基因功能研究技术

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分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术·

由GPT-5.6-Sol-Ultra生成

基因功能研究概述·

  • 基因组序列测定完成后，研究重点进一步转向基因功能及其调控机制。
  • 本章各类技术的主要研究方向
研究目的 代表性技术
研究基因表达模式 转录组测序、RNA-Seq、原位杂交
研究序列与蛋白质功能关系 基因定点突变
全部或部分抑制基因表达，并观察表型 基因敲除、RNAi
研究DNA—蛋白质相互作用 酵母单杂交、ChIP、EMSA
研究蛋白质—蛋白质相互作用 酵母双杂交、SPR、CoIP、融合蛋白沉降、FRET
借助模式细胞推测基因功能 酵母性状互补、外源基因表达

基因表达研究技术·

转录组测序分析和RNA-Seq·

转录组及传统研究方法·

  • 转录组（transcriptome）

    • 广义：特定生理或环境条件下，一个细胞、组织或生物体内全部RNA的总和，包括mRNA、rRNA、tRNA和非编码RNA。
    • 狭义：细胞中转录产生的全部mRNA。

  • 基因组—转录组—蛋白质组是中心法则在组学框架下的主要表现形式。

  • 基因表达研究的基本思路

    以特定条件下细胞内mRNA的丰度描述基因表达水平，并外推最终蛋白质产物的丰度。

  • 基于Sanger测序的传统转录组研究方法

方法 基本特点 局限
EST测序 每个转录本测定约400～500 bp；数据量大、涉及物种广 读长较短、通量小、成本高，不能由测序同时获得表达丰度
SAGE 用转录本 $3’$ 端第一个CATG位点下游14 bp标签代表相应转录本；多个标签可串联测序 标签过短，序列唯一性低
LongSAGE 标签延长至21 bp 仍约有一半标签不能准确注释到基因组
  • **高通量测序（high-throughput sequencing）**又称深度测序，包括二代和三代测序，一次可测几十万乃至几百万条序列。

二代转录组建库与RNA-Seq·

  • 二代mRNA文库构建流程

    1. 提取组织或细胞总RNA并进行质量检测。
    2. 用poly(T)磁珠富集mRNA。
    3. 将mRNA打断成短片段。
    4. 用随机引物反转录为cDNA。
    5. 进行DNA末端修复、加碱基A和加测序接头。
    6. PCR扩增并完成建库。
    7. 选择合适平台进行测序。

  • RNA-Seq

    利用高通量测序技术分析转录组，并对大量原始读长（reads）进行过滤、组装和生物信息学分析的过程。

  • 转录本组装

    • 有参考基因组：依据参考序列组装（referenced assembly）。
    • 无参考基因组：从头组装（de novo assembly），依据读长间的重叠覆盖及成对读长（pair-end reads）的相对位置，尽可能恢复完整转录本。

  • 教材以单位长度转录本上覆盖的读长数目RPKM衡量基因表达水平，英文展开记为reads per kilo-base gene per million bases。

  • 同一非重复序列上可覆盖来自不同组织的读长；将读长数目归一化为RPKM后，可筛选组织特异表达基因。


二代与三代转录组测序·

项目 二代测序 基于PacBio单分子实时测序的三代测序
转录本处理 打断后测序 建库时无需打断转录本
读长 较短 平均10～15 kb，可跨越 $5’$ 端至 $3’$-poly(A)尾的完整转录本
转录本获得方式 依靠算法组装 可直接进行全长转录组测序
主要优势 适于比较各组织或细胞样品的表达水平 可准确鉴定异构体，并分析可变剪接、融合基因、同源基因、超家族基因和等位基因表达
主要局限 可能产生较多嵌合体组装错误 价格较高，存在一定碱基测序错误
  • 实践中常采用组合策略
    1. 混合各组织进行三代测序，获得准确的全长转录物。
    2. 各组织或细胞样品分别进行二代测序，确定各基因的表达水平。

二代转录组建库测序与三代转录组建库测序流程


RNA的选择性剪接研究·

  • RNA选择性剪接

    通过选择不同的剪接位点组合，使一个mRNA前体产生不同mRNA剪接异构体的过程。

  • 选择性剪接的类型

类型 英文名称
内含子保留 intron retention
$5’$ 选择性剪接 alternative donor
$3’$ 选择性剪接 alternative acceptor
外显子遗漏型剪接 exon skipping
相互排斥性剪接 教材未列英文名称

选择性剪接的不同类型

  • RNA-Seq预测结果的RT-PCR验证
    1. 设计位于cDNA两端或不同外显子上的特异引物。
    2. 对不同组织来源样品进行扩增，比较PCR产物是否存在差异。
    3. 若有差异，对产物测序，判断差异是否来自选择性剪接。

转录组测序和RT-PCR验证棉花基因的选择性剪接

  • 生物学意义
    • 一个基因可由选择性剪接产生多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现。
    • 教材列出：人类约60%的基因可在表达中产生多种mRNA。
    • 果蝇Dscam基因最多可能产生38 016种剪接体。
    • 选择性剪接与细胞生理、发育调节及肿瘤发生和转移密切相关。

果蝇Dscam基因可产生38 000多种可能的mRNA异构体


原位杂交技术·

  • 原位杂交（in situ hybridization，ISH）

    用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核和染色体上对核酸进行定位与相对定量研究的技术。

  • 原位杂交分为

    • RNA原位杂交
    • 染色体原位杂交

RNA原位杂交·

  1. 用放射性或非放射性标记物（如地高辛、生物素）标记特异性探针。
  2. 使探针与固定的组织切片反应。
  3. 若细胞内有与探针互补的mRNA，两者杂交形成双链RNA。
  4. 检测放射性标记或进行酶促免疫显色。
  5. 在细胞水平对基因表达产物进行定性、定量分析。

组织原位杂交检测拟南芥BARD1和WUS1基因的表达模式

荧光原位杂交·

  • 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）流程
    1. 对寡核苷酸探针进行特殊修饰和标记。
    2. 通过原位杂交，使探针与靶染色体或DNA上的特定序列结合。
    3. 用与荧光素分子耦联的单克隆抗体确定该DNA序列在染色体上的位置。
  • 特点
    • 不需要放射性同位素。
    • 实验周期短、检测灵敏度高。
    • 用不同修饰的核苷酸标记不同DNA探针，可在同一切片上同时观察多种探针的位置和排列顺序。

人肌肉糖原磷酸酶基因在11号染色体上的FISH结果


基因定点突变技术·

  • 定点突变（site-directed mutagenesis）

    改变基因特定位点的核苷酸序列，进而改变其编码的氨基酸序列。

  • 主要用途

    • 研究特定氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性和配体结合能力的影响。
    • 改造DNA调控元件的特征序列。
    • 修饰表达载体或引入新的酶切位点。

  • 由于尚不能精确预测特定氨基酸变化对整个蛋白质结构和活性的影响，突变位点选择具有一定盲目性。

  • 少数氨基酸改变可能不影响功能，也可能影响活性位点，甚至从根本上改变蛋白质高级结构。因此，定点突变是研究蛋白质结构—功能关系的重要手段。

PCR介导的两种方法·

  • 重叠延伸法
    1. 模板DNA分别与引物对1（正向引物1、反向引物2）及引物对2（正向引物3、反向引物4）退火。
    2. PCR 1和PCR 2分别扩增出两个靶基因片段，突变位点位于其重叠区。
    3. 两种PCR产物在重叠区退火。
    4. DNA聚合酶补平缺口，形成含突变位点的全长双链DNA。

重叠延伸介导的定点诱变

  • 大引物诱变法
    1. 第一轮PCR用正向突变引物M和反向引物R1扩增模板，获得双链大引物PCR1。
    2. 将PCR1与野生型DNA混合、退火和复性。
    3. 第二轮PCR加入正向引物F2；F2与PCR1产生的一条互补链配对。
    4. 扩增得到带突变位点的双链DNA。
    5. F2退火温度显著高于M和R1，因此可忽略第一轮引物对第二轮反应的干扰。
    6. 对产物进行DNA序列分析，验证突变位点。

大引物诱变法

  • PCR介导定点突变的优势
    1. 突变体回收率高，有时无需筛选突变体。
    2. 可用双链DNA作模板，并在任意位点引入突变。
    3. 可在同一试管中完成全部反应。
    4. 快速、简便，无需在M13噬菌体载体上进行分子克隆。
  • 因此，PCR介导的定点突变已成为定点突变的主要技术。

基因敲除技术·

基本原理与类型·

研究路径 出发点与研究方向
经典遗传学（forward genetics） 从突变体表型出发，研究基因型并寻找相应编码序列
现代遗传学（reverse genetics，反向遗传学） 从基因序列出发，推测表型并进一步推导基因功能

  • **基因敲除（gene knock-out）**又称基因打靶

    通过外源DNA与染色体DNA间的同源重组，对基因组进行精确的定点修饰和基因改造。

  • 特点

    • 专一性强。
    • 染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传。
    • 可根据基因敲除个体的表型鉴定或推测基因功能。

  • 1985年，外源质粒pΔβ117通过同源重组插入人染色体DNA的β-珠蛋白位点，首次实现哺乳动物细胞基因打靶。

  • 两类基因敲除

类型 定义
完全基因敲除 通过同源重组完全消除细胞或动物个体内的靶基因活性
条件型基因敲除（不完全基因敲除） 通过定位重组系统，在特定时间和空间敲除基因
  • 常用定位重组系统：噬菌体Cre/LoxP、Gin/Gix，酵母FLP/FRT、R/RS；其中Cre/LoxP应用最广。

完全基因敲除·

正—负双向选择·

  • ES细胞中通常采用取代型或插入型载体，并按**正—负双向选择（positive-negative selection，PNS）**筛选同源重组细胞。
选择标记 载体位置 作用
$neo$ 插入靶DNA功能最关键的外显子，或置换靶基因功能区 形成插入突变，同时作为正向筛选标记
HSV-tk 置于目的片段外侧 作为负向选择基因；随机整合时可能随载体进入基因组，使细胞在选择培养基中死亡
  • 正确同源重组时，$neo^r$ 随目的片段进入基因组，而位于同源区之外的HSV-tk不被整合。
  • 教材图注称获得 $neo^r$ 的细胞具有“G148”抗性，并因缺失HSV-tk而对嘌呤类似物有抗性；此处按教材表述保留。

PNS法筛选发生同源重组的细胞

  • 同源重组自然发生率很低
    • 动物：$10{-2}\sim10{-5}$。
    • 植物：$10{-4}\sim10{-5}$。
  • 即使采用PNS，也必须用PCR、Southern杂交等多种分子筛选技术确认目的基因确已被敲除。

条件型基因敲除·

  • 完全敲除重要生理功能基因常导致胚胎死亡，无法继续研究其功能；条件型敲除可通过时空控制避免这一问题。

  • Cre/LoxP条件型敲除策略

    1. 将正向选择标记 $neo^r$ 置于靶基因内含子中。
    2. 在靶基因重要功能域两侧的内含子中插入方向相同的LoxP位点。
    3. 需要使靶基因失活时，与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交。
    4. Cre重组酶切除两个LoxP位点之间的DNA，导致靶基因失活。

  • 标记基因两侧也常设置LoxP位点；若内含子中的标记基因阻断靶基因转录，可用Cre表达质粒转染中靶ES细胞并删除 $neo$。

  • 通过控制Cre表达的启动子活性或Cre酶的诱导时间，可在动物特定发育阶段和组织中进行遗传修饰，减少死胎或出生后早期死亡。

条件型基因敲除策略


高等动物基因敲除技术·

  • 胚胎干细胞的分离和体外培养是哺乳动物基因敲除的技术基础。
  • 主要技术路线
    1. 构建重组基因载体。
    2. 用电穿孔或显微注射等方法将重组DNA导入ES细胞纯系。
    3. 使外源DNA与ES细胞基因组相应区段发生同源重组。
    4. 筛选并验证正确重组的ES细胞。
    5. 将基因敲除ES细胞注入早期胚胎囊胚腔，诱导胚胎分化。
    6. 获得嵌合体后与野生型回交，建立可遗传的基因敲除动物。

小鼠完全基因敲除的主要策略

  • IAP基因敲除示例
    • 用 $neo$ 替换肠碱性磷酸酶（IAP）基因外显子Ⅳ至Ⅵ。
    • Southern杂交验证基因组敲除，Northern杂交验证纯合小鼠中无IAP基因表达，Western杂交验证无IAP蛋白。
    • 高脂饲养下，IAP敲除小鼠比野生型更易发胖。

IAP基因敲除加速小鼠肥胖

  • 导入方式比较
方法 特点
显微注射ES细胞 技术难度较大，命中率相对较高
电穿孔 操作较简单，命中率较低
  • 同源重组常只发生在一条染色体上，因此获得稳定遗传的纯合基因敲除模型至少需要两代以上遗传。

基因捕获与位置效应·

  • 基因捕获：用随机插入突变破坏靶基因表达。
    • 捕获载体含无启动子的报告基因，通常为 $neo^r$。
    • 载体插入染色体后，若利用所在位点的转录调控元件表达，ES细胞便可在含G418的选择培养基上生长。
    • 分析标记基因侧翼cDNA或染色体DNA，可获得靶基因信息。

基因捕获法原理

  • 位置效应：转基因表达会受整合位点附近染色质区影响。
    • 基因 $5’$ 端启动子、增强子及 $3’$ 端终止子区均可影响转基因整合。
    • 外源基因能否有效表达有时取决于是否含内含子；内含子中的调控元件可影响mRNA剪接、启动子—内含子作用、染色体功能域开放及基因表达强度。
  • 基因敲除还可用于建立人类疾病转基因动物模型，并为遗传病治疗和生物新品种培育提供基础。

植物基因敲除技术·

T-DNA插入失活·

  • 植物中应用最广泛的基因敲除手段是T-DNA插入失活。

  • 该技术利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化，将DNA序列整合到植物宿主基因组中。

  • 农杆菌Ti质粒的主要组成

    • T-DNA区：介导DNA转移。
    • Vir基因：参与致毒及T-DNA转移。
    • 两套基因分别控制植物生长素和分裂素合成，促使创伤组织持续生长、分裂并形成冠瘿瘤。
    • 第三套基因控制冠瘿碱合成，为农杆菌生长提供所需物质。

  • T-DNA转移过程

    1. 植物根部损伤后分泌乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮。
    2. 酚类物质诱导Vir基因表达。
    3. Ti质粒上的T-DNA单链被切下。
    4. T-DNA与农杆菌染色体操纵子编码产物形成复合物。
    5. 复合物进入植物根部细胞核，T-DNA最终整合到宿主基因组。

两类改造载体·

项目 共整合载体系统 双元载体系统
组成 Ti质粒和带T-DNA的分子克隆载体 缺失T-DNA的辅助Ti质粒和带目的基因的穿梭质粒
目的基因进入T-DNA的方式 两载体在农杆菌内同源重组，使目的基因整合入Ti质粒 Vir蛋白识别、切割穿梭质粒LB与RB之间的T-DNA
两质粒关系 发生同源重组 不发生同源重组，可在农杆菌内独立复制

共整合载体系统与双元载体系统

  • T-DNA在植物基因组中一般随机整合，没有专一位点。
  • 突变体数目足够大时，理论上可建立覆盖每个功能基因的敲除植物文库。
  • 拟南芥冗余序列少、基因密度高，结合完整基因组信息，较易由T-DNA插入突变体筛选和研究新功能基因。

基因组编辑技术·

  • 基因组编辑（genome editing）

    利用序列特异性核酸酶在基因组特定位点造成DNA双链断裂，激活细胞自身的同源重组或非同源末端连接修复，从而特异性改造基因组。

  • 2013年以前常用锌指核酸酶和TALEN；CRISPR/Cas9开发后，基因组编辑应用迅速发展。

CRISPR/Cas9的天然机制·

  • CRISPR/Cas原为细菌和古菌适应性免疫系统的一部分，用于抵御病毒和外源DNA。

  • 系统由CRISPR序列和Cas基因家族组成

    • CRISPR序列由间隔序列与高度保守的正向重复序列相间排列。
    • 位于其 $5’$ 端的Cas基因簇编码可特异切割外源DNA的蛋白质。

  • CRISPR/Cas分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，以Ⅱ型应用最广。

  • Ⅱ型系统作用过程

    1. 外源DNA入侵后，CRISPR序列转录并加工为约40 nt的成熟crRNA。
    2. crRNA与tracrRNA互补配对形成双链RNA。
    3. 双RNA激活并引导Cas9识别、切割外源DNA中的原型间隔序列。

  • Cas9的两个核酸酶结构域

结构域 切割对象
HNH 与crRNA互补配对的DNA链
RuvC-like 另一条非互补DNA链
  • Cas9编辑依赖原型间隔序列下游的PAM
    • 通常为 $5’-\mathrm{NGG}-3’$。
    • 极少情况下为 $5’-\mathrm{NAG}-3’$。
    • Cas9切割位点位于PAM上游第3个碱基。

人工改造的sgRNA系统·

  • 将crRNA::tracrRNA双分子融合为含发夹结构的sgRNA（single guide RNA）。
  • sgRNA的 $5’$ 端含20 nt引导序列，可与DNA靶序列完全互补并引导Cas9编辑。
  • 只要更换20 nt引导序列，基因组上的任意 $5’-(\mathrm{N})_{20}-\mathrm{NGG}-3’$ 序列均可成为编辑靶点。

CRISPR-Cas9天然双RNA系统

融合为sgRNA的人工CRISPR-Cas9系统

植物基因组编辑流程与突变检测·

  1. 根据靶基因DNA选择20 bp引导序列及紧随其后的NGG PAM。
    • 若需破坏基因功能，应避免选择基因 $3’$ 端或内含子区序列。
  2. 将引导序列克隆到含sgRNA骨架和Cas9基因的植物表达载体中。
    • sgRNA通常由U6或U3启动子驱动。
  3. 将载体导入植物细胞，使sgRNA和Cas9瞬时或稳定表达。
  4. 通过PCR—酶切法初步鉴定Cas9靶位点处的插入或缺失。
  5. 最终用DNA测序准确确定插入或缺失的碱基。
  • 靶位点原有限制酶位点，且该位点被Cas9切割破坏
    • 野生型PCR片段仍有酶切位点，被酶切后出现两条较小条带。
    • 突变体PCR片段的酶切位点被破坏，不能被切割，仍为一条带。
  • 靶位点无合适限制酶位点：T7核酸内切酶Ⅰ检测
    • PCR产物先变性、复性。
    • 野生型双链完全匹配，T7核酸内切酶Ⅰ不能切割，电泳为一条带。
    • 突变体可形成不完全匹配双链，被T7核酸内切酶Ⅰ识别并切割，出现两条较小条带。

CRISPR-Cas9编辑植物基因组的实验流程

蛋白质及RNA相互作用技术·

酵母单杂交系统·

  • 酵母单杂交（yeast one-hybrid）

    在酵母细胞内研究DNA—蛋白质相互作用，识别稳定结合DNA的蛋白质，并可通过筛选DNA文库获得相互作用蛋白的编码基因。

  • 基本原理

    1. 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子 $P_{min}$ 上游。
    2. 将报告基因连接到 $P_{min}$ 下游。
    3. 将待测转录因子cDNA与已知转录激活结构域AD连接，构建融合表达载体并导入酵母。
    4. 若融合蛋白与顺式元件结合，AD即可激活 $P_{min}$，使报告基因表达。
    5. 连接3个以上顺式作用元件可增强转录因子的识别和结合效率。

酵母单杂交的基本原理

  • 主要用途
    • 判断特定DNA与蛋白质是否相互作用。
    • 分离结合特定顺式元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因。
    • 验证反式转录调控因子的DNA结合结构域。
    • 定位参与蛋白质结合的核苷酸序列。
    • 克隆细胞中含量极低、难以用生化方法纯化的转录调控因子。
  • 常用报告基因为HIS3或LacZ；报告基因可整合到酵母染色体上，但多数实验将其置于质粒DNA上。
  • 将未知转录因子与GAL4的DNA结合结构域融合，也可通过GAL4顺式元件下游报告基因的表达判断其是否有转录激活功能。

用DRE顺式元件筛选拟南芥转录因子


酵母双杂交系统·

  • 理论基础：转录调控因子的组件式结构

    • DNA结合结构域（BD）可与报告基因启动调控区结合，但单独不能激活转录。
    • 转录激活结构域（AD）负责激活转录。
    • 来自不同转录调控因子的BD与AD靠近时，形成的杂合系统仍可激活转录。

  • 基本流程

    1. 将已知蛋白的编码序列与酵母转录调控因子的BD基因片段连接，构建“诱饵”载体。
    2. 在酵母中表达诱饵融合蛋白，使BD结合报告基因上游调控区。
    3. 将AD基因片段分别与待筛选cDNA文库的不同插入片段连接，构建“猎物”载体。
    4. 将猎物载体转入含诱饵的酵母细胞。
    5. 若诱饵蛋白与某一猎物蛋白相互作用，BD和AD被牵引靠近，报告基因表达。
    6. 分离有报告基因活性的酵母，回收猎物载体，即可获得与已知蛋白相互作用的新基因。

  • 教材列举的BD来源常为GAL1、GAL4或GCN1转录调控因子。

酵母双杂交技术原理


蛋白质相互作用技术·

等离子表面共振技术·

  • 等离子表面共振（SPR）基本原理
    1. 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，再把葡聚糖层固定于纳米级厚度的金属膜表面。
    2. 使待测蛋白质混合物流过该表面。
    3. 若某蛋白与诱饵结合，金属膜表面折射率升高，共振角发生改变。
    4. 共振角变化与该处蛋白质浓度呈线性关系，据此检测并定量分析相互作用。
  • 优点：无需标记物和染料，安全、灵敏、快速，可定量。
  • 缺点：需要专门的SPR检测仪器。

表面等离子共振技术示意图

  • COI1—JAZ1实例
    • 芯片表面固定1 000共振单位的JAZ1。
    • 同时加入JA-Ile和COI1时，可检测到最高380共振单位的SPR信号。
    • 冠毒素COR也能促使COI1与JAZ1相互作用；JA、MeJA和OPDA无此作用。

SPR研究COI1与JAZ1的相互作用

免疫共沉淀技术·

  • **免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CoIP）**的核心是抗体对候选蛋白的特异识别。
  • 基本流程
    1. 通过亲和反应将靶蛋白抗体连接到固体基质。
    2. 加入可能与靶蛋白相互作用的待筛选蛋白。
    3. 若二者相互作用，待筛选蛋白会通过靶蛋白—抗体—基质形成复合物。
    4. 用低速离心或微膜过滤使复合物沉淀到管底或微膜上。
    5. 分析共沉淀蛋白，判断相互作用。

免疫共沉淀原理

  • 教材所列融合表达和检测示例
    • pGADT7、pGBKT7分别以融合蛋白形式表达靶蛋白。
    • 体外转录、翻译后混合温育，用Myc或HA抗体沉淀。
    • 过柱并经SDS-PAGE分离，检测两个靶蛋白是否相互作用。
    • 结果：棉花ACS2与CDPK1相互作用，但与CDPK32及CRK5不相互作用；ACO1与这3种蛋白均不相互作用。

c-Myc-ACS2和HA-CDPK1免疫共沉淀载体构建

GST及GAD融合蛋白沉降技术·

  • GST融合蛋白沉降利用GST对谷胱甘肽偶联琼脂糖球珠的亲和性，从混合样品中纯化相互作用蛋白。
  • 两类用途
    • 判断探针蛋白与未知蛋白之间是否相互作用。
    • 确证探针蛋白与某个已知蛋白之间的相互作用。

GST融合蛋白沉降技术流程

  • GAD—PIF3融合蛋白实例
    • 将GAD与PIF3不同区段连接为钓饵，检测其与phyB、缺失N端37个氨基酸的phyB突变体及phyA的体外相互作用。
    • 超过30%的phyB可被PIF3沉降，表明相互作用强。
    • 约5%的phyA和约10%的N端37个氨基酸缺失型phyB可被沉降，表明相互作用较弱。

融合蛋白沉降检测PIF3与光敏素的相互作用

荧光共振能量转移·

  • 荧光共振能量转移（FRET）

    荧光能量给体和受体通过偶极—偶极耦合，以非辐射方式转移能量的过程，又称长距离能量转移。

  • 教材称FRET现象于21世纪初叶被发现。

  • 发生FRET的3个基本条件

    1. 给体与受体的距离合适，为1～10 nm。
    2. 给体发射光谱与受体吸收光谱有一定重叠，实现能量匹配。
    3. 给体与受体的偶极具有一定空间取向，满足偶极—偶极耦合条件。

  • 探针对还要求给体发射光谱与受体发射光谱尽量不重叠。

  • 常用探针

类型 教材列举及特点
荧光蛋白 GFP、BFP、CFP、YFP等，可依据吸收和发射波长配对
传统有机染料 荧光素、罗丹明、Cy3、Cy5等；体积小、种类多、商品化程度高
镧系染料 常与有机染料联合用作给体或受体，可提高准确性和信噪比
  • 研究蛋白质相互作用时常将FRET与荧光成像联用
    • 蛋白质不相互作用：距离较大，无FRET。
    • 蛋白质相互作用：距离缩短，发生FRET，可由成像颜色变化直观记录。

荧光共振能量转移


染色质免疫共沉淀技术·

  • 染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）

    研究活细胞内染色质DNA与蛋白质相互作用的技术。

  • 主要流程

    1. 在活细胞状态下固定蛋白质—DNA复合物。
    2. 用超声或酶处理，将染色质随机切成一定长度的小片段。
    3. 利用抗原—抗体特异识别沉淀复合物，富集与目的蛋白结合的DNA。
    4. 纯化目的DNA片段并进行测序分析。

  • 可获得的信息

    • 与目的蛋白相互作用的DNA序列特征及其基因组位置。
    • 结合亲和程度或结合强度。
    • 相互作用对基因表达的影响。

  • 主要应用

    • 定性或定量检测体内转录调控因子与DNA的动态作用。
    • 研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系。
    • 将目的蛋白定位到功能基因的启动子区或附近，辅助推测其生物学功能。

染色质免疫共沉淀的主要实验流程

用H3K4me3抗体研究棉花全基因组组蛋白修饰


RNAi技术及其应用·

  • RNAi（RNA interference，RNA干涉）

    利用双链小RNA高效、特异地降解细胞内同源mRNA，阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失表型。

  • RNAi是多步骤过程，包括

    1. 触发物加工。
    2. 与目标mRNA结合。
    3. 目标mRNA降解。

RNAi作用机制·

  1. 较长的外源双链RNA（30 nt以上）作为触发物进入细胞。
  2. Dicer（一种具有RNAase Ⅲ活性的核酸酶）将其加工为21～25 nt的siRNA。
  3. siRNA定位目标mRNA，是基因沉默及序列特异性RNA降解的重要中间媒介。
  4. siRNA反义链参与形成RNA诱导沉默复合体RISC。
  5. RISC切割目的mRNA上与siRNA反义链互补的区域，抑制靶基因表达。
  • siRNA的结构特征
    • $5’$ 端为磷酸基团，$3’$ 端为羟基。
    • 两条链的 $3’$ 端各有2个碱基突出于末端。
  • 较短双链RNA不能有效加工成siRNA，因而不能按教材所述途径介导RNAi。
  • siRNA还可作为特殊引物，在依赖RNA的RNA聚合酶作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA；新dsRNA再生成siRNA并进入循环，使低量外源信号得到放大。

RNAi作用机制

  • 不同细胞中的实验特点
细胞类型 教材所述特点
哺乳动物细胞 长dsRNA会导致非特异性沉默；只有21～25 nt的siRNA能有效引发特异性沉默
非哺乳动物细胞 可由较长dsRNA直接诱导RNAi；体外转录目的基因获得dsRNA，再浸泡、注射或转染靶细胞即可

在酵母细胞中鉴定靶基因功能·

  • 酿酒酵母是单细胞真核生物，具有细胞核、内质网、高尔基体、线粒体、过氧化物酶体和细胞骨架等结构。
  • 酵母与动植物细胞在生长发育过程上相似，许多基因高度保守，且易于进行生物化学和分子生物学操作，因此是常用模式生物。

酵母基因转化与性状互补·

  • YIp整合型质粒可用于精确敲除或置换酵母基因组中的基因，并通过孢子繁殖中的四分体分析观察结果。

  • 致死突变的性状互补

    1. 构建携带致死突变位点和候选外源功能互补基因的二倍体酵母。
    2. 在饥饿条件下使二倍体形成四分体孢子。
    3. 用四分体分离系统分开4个孢子。
    4. 若外源基因能互补突变功能，携带突变基因的单倍体可存活；否则不能存活。

  • 棉花KCS基因互补实例

    • 酵母elo2Δelo3Δ是超长链脂肪酸合成酶双突变的致死型单倍体。
    • 将棉花KCS12、KCS6、KCS2、KCS13分别克隆到带URA3标记的表达质粒中，用其替换带TRP1标记的质粒。
    • KCS12和KCS6可完全恢复野生型表型。
    • KCS13和KCS2未完全恢复野生型表型，但可使酵母恢复生长。
    • 说明这些KCS基因均具有与elo2或elo3相似的功能。

棉花KCS基因对酵母elo2Δelo3Δ突变体的互补


外源基因在酵母中的功能鉴定·

  • 基本思路
    1. 将外源基因克隆到酵母表达载体。
    2. 转化野生型或突变型酵母。
    3. 观察酵母表型变化或分析细胞化学成分。
    4. 据此推测外源基因的生物学功能。
  • 亚细胞定位：在酵母中表达外源蛋白—GFP融合蛋白，通过荧光显微镜观察荧光位置，判断基因产物的细胞内定位。
  • GhKCS功能实例
    • 将棉花GhKCS转入野生型酵母并诱导表达。
    • 用气相色谱和质谱分析细胞脂肪酸组成。
    • 与野生型相比，转基因酵母中C22:0大量增加，C24:0和C26:0大量减少。
    • 据此推测GhKCS主要编码合成C22:0型超长链脂肪酸的酶。
  • 教材称酵母具有与动植物较接近的“蛋白质转录后修饰系统”，因此许多不能在大肠杆菌中产生功能蛋白的动植物基因，在酵母中表达后能够发挥功能。

这里的“蛋白质转录后修饰”与本章前文“蛋白质翻译后修饰加工”的口径不一致，两者均按教材原文保留。

用气相色谱分析酵母中的GhKCS功能

其他分子生物学技术·

凝胶滞缓实验·

  • 凝胶滞缓实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）

    在体外分析DNA—蛋白质相互作用的特殊凝胶电泳技术。

  • 基本原理

    • DNA与蛋白质结合后，复合物的相对分子质量显著增加。
    • 未结合蛋白质的DNA迁移较快；DNA—蛋白质复合物受到凝胶阻滞，迁移较慢。
    • 特定DNA与细胞提取物混合后若迁移率降低，说明该DNA可能与提取物中的蛋白质发生相互作用。

  • 该方法简单、快速，是分离纯化特定DNA结合蛋白质的经典方法。

  • 实验流程

    1. 通常用 $^{32}\mathrm{P}$ 标记待测DNA探针，不标记蛋白质。
    2. 将探针与细胞提取物共同温育，形成可能的DNA—蛋白质复合物。
    3. 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。
    4. 用放射自显影显示DNA条带位置。

  • 结果判断

    • 无结合蛋白：放射性标记随自由探针迁移到凝胶底部。
    • 存在结合蛋白：复合物迁移减慢，标记条带滞留在凝胶较上部的位置。

EMSA比较棉花ACO3启动子不同区域的蛋白质结合能力


噬菌体展示技术·

  • 噬菌体是细菌病毒，依赖宿主的核糖体、蛋白质合成因子、氨基酸和能量代谢体系增殖。
周期 特点 相应噬菌体
溶菌周期 将宿主转变为噬菌体“制造厂”，产生大量子代噬菌体 只进行溶菌生长的称烈性噬菌体
溶原周期 噬菌体DNA整合入宿主染色体，感染过程中不产生子代颗粒 温和噬菌体

  • 噬菌体展示技术

    将基因表达产物与亲和选择相结合，使外源多肽以噬菌体外壳融合蛋白的形式展示，并用于捕获相互作用蛋白。

  • 基本过程

    1. 将编码诱饵蛋白的DNA插入噬菌体基因组，并与外壳蛋白基因融合。
    2. 重组噬菌体侵染宿主细菌，复制产生带杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒。
    3. 用这些颗粒捕获靶蛋白库中与诱饵相互作用的蛋白质。

  • pⅢ和pⅧ均可展示外源多肽

外壳蛋白 展示强度
次要结构蛋白pⅢ 低，每个噬菌体不超过5个拷贝
主要结构蛋白pⅧ 高，每个噬菌体约2 700～3 000个拷贝
  • 两类蛋白的信号肽与成熟蛋白编码区之间均有单一克隆位点；融合蛋白被分泌至细胞间质，信号肽被宿主蛋白酶切除，成熟融合蛋白展示在病毒颗粒表面。

噬菌体展示技术研究蛋白质相互作用

亲和筛选·

方法 操作
直接法 将靶蛋白耦联到固相支持物；与文库噬菌体温育后洗去未结合者，保留有亲和性的噬菌体
间接法 生物素标记靶蛋白，与文库噬菌体温育后铺于含链霉亲和素的平皿；洗去未结合者，保留结合噬菌体
  • 洗脱结合噬菌体后感染细菌并扩增，再进入下一轮筛选；连续数轮亲和纯化可选择性富集、扩增与靶蛋白结合的噬菌体。

蛋白质磷酸化分析技术·

  • 蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶催化的可逆磷酸化，是调节细胞生长发育、周期、基因表达、蛋白质合成、神经功能和肌肉收缩等过程的重要方式。

  • 复杂信号转导系统中可存在由多个蛋白激酶催化的磷酸化级联反应。

  • 磷酸化与去磷酸化

    • 蛋白激酶通常把ATP或GTP的γ-磷酸基团转移到底物蛋白的Ser、Thr或Tyr残基。
    • 蛋白磷酸酯酶催化底物蛋白去磷酸化。
    • 教材还列出可发生可逆磷酸化的残基：His、Lys、Arg、Asp、Glu和Cys。

  • 检测方法

    • 一般可用双向电泳和质谱分析检测底物蛋白磷酸化。
    • 细胞内可能有多达上千种蛋白激酶，体内测定某一种激酶活性困难，因而常用体外激酶活性分析。

  • 体外激酶活性分析主要分为两步

    1. 获取底物蛋白和待测蛋白激酶；可直接从组织提取，也可用原核或真核表达载体诱导表达。
    2. 进行体外蛋白质磷酸化反应，判断激酶活性并筛选特异性底物。

蛋白激酶体外磷酸化活性分析

  • CDPK1底物特异性实例
    • 将棉花钙离子依赖性蛋白激酶CDPK1分别与ACS2、ACO1和SUS置于体外磷酸化体系。
    • 有 $Ca^{2+}$ 时，ACS2能被有效磷酸化，ACO1和SUS不能。

CDPK1体外磷酸化底物特异性


蛋白质免疫印迹实验·

  • 蛋白质免疫印迹（Western blotting）

    在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定基础上，利用抗原—特异性抗体反应检测样品中蛋白抗原的方法。

  • 教材所述基本原理还包括：被测蛋白质与标记的特异性抗体结合，且这种结合不改变该蛋白质在凝胶电泳中的相对分子质量。

  • 特点与用途

    • 高效、简便、灵敏。
    • 检测样品中是否存在特定蛋白抗原。
    • 测定抗原的相对丰度或其与其他已知抗原的关系。
    • 评价新抗体的特异性。

  • 5步基本程序

    1. 制备蛋白质样品。
    2. 用SDS-PAGE分离样品。
    3. 将蛋白质转移到尼龙或其他膜上，并封闭膜上未反应位点，抑制抗体非特异吸附。
    4. 以膜上蛋白为抗原，与非标记的一抗结合。
    5. 洗去未结合一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，经显色或放射自显影检测蛋白质。

  • 影响实验成败的因素

    • 抗原表位性质：一抗应能识别凝胶电泳、转膜后的变性蛋白，并尽量避免交叉反应。
    • 蛋白原液中的抗原浓度：教材称相对分子质量约 $5\times10^4$ 的蛋白质需大于0.1 ng才能检出；检测更低量蛋白时需进一步纯化样品。

细胞定位及染色技术·

  • 蛋白质在组织和细胞内的定位与其生物学功能密切相关。
  • 常用定位方法
    • 荧光蛋白标记
    • 免疫荧光法

GFP标记·

  • GFP由238个氨基酸组成。
光谱性质 峰值 特点
主要吸收峰 395 nm 紫外光激发
另一吸收峰 475 nm 蓝光激发
发射峰 509 nm、540 nm 绿色或黄绿色荧光
  • 两种融合策略
    • 将GFP编码序列与目的基因启动子融合，形成嵌合基因。
    • 将GFP编码序列与目的蛋白编码序列直接连接，形成融合基因。
  • 可用花序浸染、基因枪、显微注射、愈伤组织转化或细胞转染等方法导入植物组织或动物细胞。
  • 融合基因使用与目的基因相同的表达调控元件，可通过荧光显微镜观察GFP在组织或亚细胞中的分布，据教材推定目的蛋白定位。
  • AtWOX5实例
    • 将AtWOX5启动子与GFP编码序列融合，经花序浸染转化野生型拟南芥。
    • GFP信号指示WOX5定位于根端分生组织RAM的静止中心QC。
    • 红色荧光为PI染色的细胞壁，绿色荧光为GFP自发荧光。

拟南芥中WOX5pro-GFP融合基因的表达

免疫荧光·

  • 免疫荧光技术

    将抗原—抗体特异结合与荧光标记结合，用于研究特异蛋白抗原在细胞内的定位。

  • 用荧光标记的特异抗体作为分子探针检测细胞或组织中的相应抗原；抗原—抗体复合物带有荧光素，可在荧光显微镜下确定抗原蛋白的位置。

  • 教材实例：结核杆菌外膜蛋白刺激巨噬细胞15 min，使NF-$\kappa$B由胞质转入细胞核；FITC绿色荧光标记NF-$\kappa$B，DAPI蓝色荧光标记核DNA。

免疫荧光观察NF-kappaB在巨噬细胞中的定位变化


全基因组关联分析及应用·

  • 全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）

    在人类或动植物全基因组中，以百万计的单核苷酸多态性（SNP）为分子遗传标记，通过全基因组水平的对照或相关性分析，寻找影响复杂性状的基因变异。

  • 发展节点

    • 1996年，Risch提出GWAS设想。
    • 2001年，Hansen等用GWAS发现海甜菜春化抽薹基因与两个全基因组标记位点关联。
    • 2005年，Science报道首篇用GWAS研究人年龄相关性视网膜黄斑变性疾病基因网络的论文。

  • 总体分析思路

    1. 在全基因组范围内选择遗传变异并进行基因分型。
    2. 比较实验组和对照组中各变异及其频率差异。
    3. 统计各变异与目标性状的关联程度。
    4. 选择最相关的遗传变异进行验证。
    5. 根据验证结果确认其与目标性状的相关性。

  • 典型GWAS流程

    1. 建立研究群体，尽可能扩大样本量并建立目标性状库。
    2. 提取各样本DNA并测序，获得群体基因型。
    3. 用适当统计模型建立SNP与目标性状的关联。
    4. 用实验最终确认相关性。

  • 棉花种子油实例

    • GWAS发现棕榈酸C16:0和棕榈油酸C16:1含量与11号染色体上的SNP关联。
    • 最高SNP位点位于GaKAS Ⅲ第一个外显子。
    • 该非同义SNP使精氨酸变为半胱氨酸；教材据此认为该突变导致不同棉花群体的种子油分差异。

GWAS鉴定棉花种子油脂肪酸含量相关基因

GWAS鉴定结果中的关联区域

本章名词·

定点突变｜site-directed mutagenesis　⭐真题

定点突变(site-directed mutagenesis)是重组DNA进化的基础技术，通过改变基因特定位点的核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列。该方法常用于研究特定氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性及配体结合能力的影响，也可用于改造DNA调控元件、修饰表达载体或引入新酶切位点。它是研究蛋白质结构与功能关系的重要手段，但由于难以精确预测氨基酸变化对蛋白质整体结构的影响，突变位点的选择仍存在一定盲目性。

噬菌体｜bacteriophage

是感染细菌的病毒。烈性噬菌体的感染最终导致宿主细胞裂解, 而温和型噬菌体则能将 DNA 整合到宿主细胞染色体上, 从而对宿主造成较为长期的影响。在特定条件下两者可以转换。

基因敲除｜gene knock-out

针对一个序列已知但功能未知的基因, 从 DNA 水平上设计实验, 彻底破坏该基因的功能或消除其表达机制, 从而推测该基因的生物学功能。

FRET｜FRET

荧光共振能量转移（FRET）是指荧光能量给体与受体之间通过偶极－偶极耦合作用以非辐射方式转移能量的过程，又称长距离能量转移。该过程需要满足三个条件：给体与受体距离在1~10 nm；给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定重叠；给体与受体的偶极具有适当的空间取向。FRET常用于研究细胞内蛋白质相互作用，常用探针包括荧光蛋白（如GFP、BFP、CFP、YFP）和有机染料（如Cy3、Cy5）等。

RNAi技术｜RNAi technology

RNAi技术是一种利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断靶基因表达、使细胞呈现靶基因缺失表型的技术。其机制是：外源或内源的双链RNA（dsRNA）被Dicer核酸酶加工成21~25个核苷酸的siRNA，随后siRNA的反义链与RNA诱导的沉默复合体（RISC）结合，指导RISC切割与反义链互补的靶mRNA，导致其降解。该过程主要发生在转录后水平，可引起基因沉默，广泛应用于基因功能研究。

酵母单杂交系统｜yeast one-hybrid system

酵母单杂交系统是一种在酵母细胞内研究DNA-蛋白质相互作用的技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。其基本原理是将已知顺式作用元件构建到最基本启动子上游，下游连接报告基因，再将待测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域AD融合表达，若该蛋白与顺式作用元件结合，则激活基本启动子使报告基因表达。该系统是分析鉴定转录调控因子与顺式作用元件相互作用的有效方法。

酵母双杂交系统｜yeast two-hybrid system

酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是一种在酵母细胞内检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。该系统利用真核转录激活因子的组件式结构特征，即DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）可分离且单独不具活性，但当两者通过诱饵蛋白与猎物蛋白的相互作用而空间接近时，可重构转录激活功能，驱动报告基因表达。实验中将已知蛋白与BD融合作为诱饵，将待筛选蛋白与AD融合作为猎物，通过报告基因的激活鉴定相互作用。

烈性噬菌体｜virulent phage

烈性噬菌体是指只具有溶菌生长周期的噬菌体。它感染宿主细菌后，通过溶菌周期将宿主细胞转变成噬菌体“制造厂”，产生大量子代噬菌体颗粒，最终导致宿主细胞裂解。与温和噬菌体不同，烈性噬菌体不进入溶原周期，其DNA不整合到宿主染色体上。

免疫共沉淀技术｜co-immunoprecipitation

免疫共沉淀技术（co-immunoprecipitation, CoIP）是一种利用抗体特异性识别靶蛋白来研究蛋白质间相互作用的技术。其核心是将靶蛋白的抗体连接至固体基质上，再与可能发生相互作用的待筛选蛋白共同孵育，通过低离心力沉淀或微膜过滤法分离抗体-靶蛋白-待筛选蛋白复合物，从而富集并鉴定与靶蛋白结合的蛋白质。该技术可用于确证已知蛋白质间的相互作用或筛选未知相互作用蛋白。

凝胶滞缓试验｜gel retardation assay

凝胶滞缓试验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊凝胶电泳技术。其原理是蛋白质与DNA结合后相对分子质量增加，导致DNA-蛋白质复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移速率较游离DNA显著减慢。实验中通常用放射性同位素标记DNA探针，与细胞提取物共温育后进行电泳和放射自显影，通过迁移位置变化判断相互作用。该方法简单快捷，是分离纯化特定DNA结合蛋白质的经典方法。

温和噬菌体｜temperate phage

温和噬菌体是指具有溶原周期的噬菌体。在溶原周期中，其DNA整合到宿主细胞染色体DNA上，成为宿主基因组的一部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。与只具有溶菌周期的烈性噬菌体不同，温和噬菌体可通过溶原周期维持其遗传物质在宿主细胞内的持续存在。

荧光原位杂交｜fluorescence in situ hybridization

荧光原位杂交(FISH)是用经特殊修饰和标记的寡核苷酸探针与靶染色体或DNA上的特定序列原位杂交，再通过与荧光素分子耦联的单克隆抗体检测，以确定该DNA序列在染色体上位置的分子技术。这一方法可对核酸进行定位与相对定量，常用于基因组物理图谱的构建。

杂交｜hybridization

杂交是指两条互补的核酸单链通过碱基配对形成双链分子的过程。该技术基于核酸的互补结合特性，常用标记探针检测靶核酸序列或研究生物大分子相互作用，是分子生物学中核酸分析与文库筛选的常用方法。

转录组｜transcriptome

转录组分为广义和狭义：广义指特定生理条件下细胞、组织或生物体中所有RNA的总和，包括mRNA、rRNA、tRNA及非编码RNA；狭义特指所有mRNA的总和。基因组-转录组-蛋白质组构成中心法则的组学框架，通过mRNA丰度可反映基因表达水平并外推至蛋白质丰度，是基因表达研究的基本思路。

BS-seq｜Bisulfite Conversion followed by Sequencing, 亚硫酸氢盐转化后测序

分析基因组 DNA 甲基化状态的另一种方法, 用亚硫酸氢盐处理 DNA 分子后进行测序分析。

ChIP-seq｜Chromatin Immunoprecipitation followed by Sequencing, 染色质免疫共沉淀后测序

将样本与特异抗体免疫共沉淀后进行测序分析, 主要用于分析转录因子、组蛋白等结合的 DNA 序列。

DNase-seq｜DNaseI Hypersensitivity Site Footprinting coupled with Sequencing, DNaseI 超敏感位点足迹法偶联测序

DNase-seq 被用于鉴定基因组上没有核小体结构的区域,因为这些区域易被 DNaseI 降解。

GWAS｜Genome-Wide Association Study, 全基因组相关分析

用于检测不同个体的共同遗传变体与某一性状之间的相关性。

基因组编辑技术｜genome editing

利用序列特异核酸酶在基因组特异位点产生DNA双链断裂,从而激活生物体自身的同源重组或非同源末端连接修复机制,以达到特异性改造基因组之目的。

免疫共沉淀｜CO-Immunoprecipitation, CO-IP

当细胞在非变性条件下被裂解时, 完整细胞内存在的许多蛋白质 - 蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X, 那么在体内与 X 结合的蛋白质 Y 也能被沉淀下来。

凝胶滞缓实验｜DNA mobility shift assay, EMSA

是一种检测蛋白质和 DNA 序列相互结合的技术, 其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合, 电泳时这种复合物比没有蛋白结合的探针在凝胶中泳动速度慢, 表现为相对滞后。该方法可用于检测 DNA 结合蛋白、RNA 结合蛋白, 并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质。

全基因组关联分析｜Genome-wide association study, 缩写名为 GWAS

是一种在人类或动植物全基因组中以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism, SNP)为分子遗传标记, 进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析, 通过比较发现影响复杂性状基因变异的一种新策略。

小分子干扰核糖核酸｜siRNA, short interfering RNAs

是长度为 21~25 个核苷酸的双链小分子 RNA, 它是引发转录后基因沉默中序列特异性的 RNA 降解的重要中间媒介。siRNA 具有 5’ 端磷酸基和 3’ 端羟基，两条链的 3’ 端各有两个碱基突出于末端。在转录后沉默和 RNAi 的过程中，siRNA 作为识别目标基因的引导物。

野生型和突变型｜wild-type and mutant

生物学上把所研究的基因位点未发生改变的生物个体称为野生型, 把所研究的基因位点发生遗传突变的生物个体称为突变型。因此, 野生型和突变型是相对的, 甚至可能根据所研究目的基因的不同而发生转换。