基因及蛋白质工程

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基因工程、蛋白质工程及相关技术·

由GPT-5.6-Sol-Ultra生成

  • 基因工程（genetic engineering）

    对携带遗传信息的基因进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。

  • 基因工程的核心是构建重组体DNA，因此基因工程与重组体DNA技术有时同义
  • 发展标志
    • 1972年：P. Berg等首次构建DNA重组体
    • 1973年：S. Cohen和H. Boyer将体外重组质粒导入大肠杆菌，经繁殖获得基因的分子克隆
  • 蛋白质工程（protein engineering）

    根据蛋白质已知的结构与功能，借助计算机辅助设计和基因定位诱变等技术改造蛋白质，以改进其性能。

  • 蛋白质工程建立在基因工程基础上；1983年K. M. Ulmer首先提出这一名称

DNA克隆的基本原理·

DNA克隆·

  • 克隆（clone）：无性繁殖系
  • DNA克隆/基因的分子克隆

    将DNA限制酶切片段插入可自主复制的载体，导入宿主细胞，经无性繁殖获得相同DNA扩增分子的过程。

  • 基本流程
    1. 获得目的DNA限制片段
    2. 将目的片段与载体DNA连接成重组体
    3. 将重组体导入宿主细胞
    4. 筛选、繁殖含重组体的克隆

DNA限制酶与片段连接·

修饰-限制系统·

  • 细菌的修饰-限制系统用于区分自身DNA与外来DNA
    • 修饰酶：修饰宿主DNA，使其带有标记
    • 限制性内切核酸酶（restriction endonuclease，限制酶）：切割无标记的外来DNA
  • 限制酶命名
    • 取菌属名第一个字母、种名前两个字母，必要时再取株名一个字母
    • 同一菌株分离出多种酶时，以罗马数字表示分离次序
    • 修饰性甲基化酶标以M；限制酶原应标以R，但R通常省略
    • 例：M·Hind II与Hind II、M·EcoR I与EcoR I
类型 组成与活性 识别和切割特点 工程用途
I型 S、M、R三类亚基组成的多亚基双功能酶；S识别，M甲基化，R切割 识别位点分为两段；在距识别位点至少1 kb处随机切割；切割需ATP 切割随机，基因操作中无实际用途
II型 修饰酶与限制酶彼此分开；甲基化酶为一条多肽链，限制酶由两条相同多肽链组成 常识别4～6 bp回文序列；在识别位点内或附近切割，可产生平末端或黏性末端 —
III型 M、R两亚基组成的双功能酶；M识别和修饰，R切割 修饰和切割均需ATP；在识别位点下游24～26 bp处切割 教材未强调具体用途
  • I型酶根据识别位点的甲基化状态决定反应
    • 两条链均甲基化：不反应，酶水解ATP后脱落
    • 半甲基化：使未甲基化链甲基化
    • 两条链均未甲基化：在远离识别位点处切割DNA
  • II型酶的甲基化酶可产生5-甲基胞嘧啶、4-甲基胞嘧啶或6-甲基腺嘌呤
    • 两条链均甲基化：不反应
    • 两条链均未甲基化：被限制酶切割

II型限制酶的切割产物·

  • 两条DNA链对应位置切开 → 平末端
  • 两条链交错切开 → 形成单链突出端
    • 两个末端的单链彼此互补，可重新配对，称为黏性末端
    • 已知限制酶中，产生 $5’$ 单链突出端者超过一半；平末端和 $3’$ 突出端较少
  • 同裂酶（isoschizomer）

    来源不同，但识别位点和切割位点完全相同的限制酶。

  • 同尾酶

    切割后仅突出单链相同的限制酶。

  • 同尾酶产生的片段可以相连；连接位点若不再符合两种原酶的识别序列，则不再被原酶切割
    • 教材例：BamH I与Bgl II片段连接后形成的新序列不能再被二者切割

DNA连接酶·

  • 相容末端（compatible end）：能够彼此配对并由DNA连接酶连接的DNA末端
DNA连接酶 能量来源 可连接的末端
T4 DNA连接酶 ATP 黏性末端、平末端
大肠杆菌DNA连接酶 $NAD^+$ 仅黏性末端
  • DNA连接反应通常使用T4 DNA连接酶
  • 黏性末端可先通过碱基互补配对，因而连接效率较高
  • 提高平末端连接效率的方法
    1. 提高T4 DNA连接酶浓度
    2. 提高DNA片段浓度
    3. 降低ATP浓度，增强连接酶与DNA的结合
    4. 加入亚精胺等多胺，降低DNA间静电排斥
    5. 加入PEG或三氯化六氨钴等浓缩剂
  • 相容末端片段既可分子间串联，也可自身环化
    • 链短、浓度低 → 有利于自身环化
    • 链长、浓度高 → 有利于分子间串联

DNA黏性末端和平末端的连接

DNA平末端的连接

平末端转化为黏性末端·

方法 结构与作用 是否需再用限制酶切
接头（linker） 含限制酶识别序列的回文寡核苷酸；自配对成双链，先接到平端，再切出黏端 需要
多接头（polylinker） 同一合成片段紧密排列多种限制酶识别序列 视用途而定
衔接物（adaptor） 两条互补寡核苷酸配对后，一端平、一端黏，或两端为不同黏端 不需要
  • 限制酶识别位点太靠近DNA末端时，酶活性可能降低，因此接头通常长于单纯识别序列
    • EcoR I接头GGAATTCC共8 nt，已足以被切割
    • Hind III接头CCCAAGCTTGGG共12 nt，仍可能酶切不完全
  • 互补均聚核苷酸末端连接
    1. 末端核苷酸转移酶在DNA片段 $3’-OH$ 端分别加寡聚dT/dA或dC/dG
    2. 两段DNA依靠互补均聚尾配对
    3. Klenow酶填补缺口
    4. T4 DNA连接酶封闭缺刻
  • 互补均聚尾可显著提高连接效率

互补均聚核苷酸末端的连接

  • 基因工程常用工具酶还包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA聚合酶、多核苷酸激酶、磷酸酯酶、外切核酸酶和内切核酸酶等

分子克隆的载体与宿主·

载体的定义与要求·

  • 载体（vector）

    将外源DNA带入宿主细胞并使其复制的运载工具。

  • 克隆载体具有复制起点，可在受体细胞内自主复制，因而是一个复制子
  • 常由质粒、病毒或可自主复制的染色体DNA改造而成
    • 细菌和真菌：常用质粒，特殊要求时使用噬菌体
    • 动、植物：较多使用病毒或染色体DNA构建
  • 克隆载体的基本要求
    1. 能自主复制
    2. 携带易于筛选的选择标记
    3. 含多种限制酶的单一识别序列，供外源DNA插入
    4. 除必要序列外尽可能小，便于导入和繁殖
    5. 安全：宿主范围有限，在体内不重组、不转移、不产生有害性状，不能离开工程宿主扩散
  • 常用选择标记
    • 抗性基因：$ampr$、$tetr$、$chlr$、$kanr$ 等
    • 营养合成基因：补足营养缺陷型宿主，使其能在基础培养基生长
  • 分子重排（rearrangement）

    将过大的载体切成小片段后随机连接，再筛选具有抗性、拷贝数多且长度较小的载体。

  • 构建载体时常插入合成多接头，使多种限制酶位点在载体中均为单一位点；不合适的序列可用定位诱变改造

质粒载体·

pBR322·
  • 全长4361 bp，含 $tetr$、$ampr$ 和复制起点ori
  • 由天然质粒经删除、融合、转座和重排等操作构建
  • 拷贝控制
    • 原始严紧型质粒：每细胞1～2个拷贝
    • pBR322为松弛型：每细胞25个拷贝以上
    • 加入氯霉素或链霉素抑制细胞生长和染色体复制后，质粒可达1000～3000拷贝

质粒pBR322

pUC系列与蓝白筛选·
  • pUC载体由四部分组成
    1. 来自pBR322的复制起点ori
    2. 经改造、不再含原限制位点的 $amp^r$
    3. lac调节区、启动子 $p_{lac}$ 和编码 $\alpha$ 肽的 $lacZ’$
    4. 位于 $lacZ’$ 靠近 $5’$ 端的多克隆位点（MCS）
  • 蓝白筛选的原理
    • 宿主的 $lacZ\Delta M15$ 缺失 $\beta$-半乳糖苷酶N端片段，酶无活性
    • 载体 $lacZ’$ 编码的 $\alpha$ 肽可补足该缺失，形成 $\alpha$ 互补
    • IPTG诱导后，活性酶分解X-gal并产生靛蓝
    • 空载体：$lacZ’$ 完整 → 蓝色菌落
    • 插入外源DNA：$lacZ’$ 失活 → 白色菌落
  • pUC载体的其他特点
    • 删除rop后，每细胞可达500～700个拷贝
    • 删除nic/bom位点，不发生转移
    • pUC18与pUC19仅多接头方向不同

蓝白筛选中，白色菌落是重组体候选克隆，蓝色菌落通常携带空载体。

功能扩展型质粒·
载体 插入的功能序列 主要功能
pUC118/119 M13基因间隔区及单链复制起点 在M13辅助噬菌体帮助下产生单链DNA模板
pSP系列 多接头一端插入SP6启动子 用SP6 RNA聚合酶进行体外高效转录
pGEM系列 多接头两端插入T7、SP6启动子，并含f1 IG区 两个方向体外转录，也可形成单链DNA
Bluescript M13 多接头两端插入T3、T7启动子，并含f1 IG区 两个方向体外转录，也可形成单链DNA
  • 噬菌粒（phagemid）：含噬菌体复制起点的质粒，可在辅助噬菌体帮助下按噬菌体方式复制和装配
    • pUC118/119、pGEM和Bluescript M13均属噬菌粒
  • 穿梭质粒（shuttle plasmid）：含两种宿主细胞的复制起点，可在两类细胞中复制
  • 表达载体（expression vector）：插入控制外源基因在宿主中表达的序列

$\lambda$ 噬菌体载体与黏粒·

  • $\lambda$ 噬菌体基因组
    • 双链DNA，约50 kb
    • 两端各有12 nt黏性末端，入胞后配对形成环状DNA
    • 可经裂解途径增殖，也可整合入细菌染色体进入溶原途径
    • 约 $1/3$ DNA对复制和装配非必需，可由外源DNA替换
  • $\lambda$ 载体的两种形式
类型 克隆方式
插入型 载体在一个限制位点切开，直接插入相容的外源片段
置换型 先切除载体中间片段，再以外源DNA替换
  • 重组体总长度必须为天然 $\lambda$ DNA的 78%～105%，才可装配成病毒颗粒
  • 优点：噬菌体感染可高效将重组DNA导入细胞，适合构建文库
  • 容量：最多携带约23 kb外源DNA

以lambda噬菌体载体克隆DNA

  • $\lambda$ DNA滚环复制形成以cos位点相连的多联体（concatemer）
    1. Nu1和A蛋白结合左侧cos位点，把DNA引至头部前体入口
    2. DNA填满头部时，第二个cos位点到达入口
    3. A蛋白交错切开两个cos位点，产生黏性末端
    4. 头、尾分别装配后结合成成熟颗粒
  • 黏粒/柯斯质粒（cosmid）

    含cos位点的质粒。

  • 黏粒特点
    • 可携带35～48 kb外源DNA，主要用于构建基因组文库
    • 两cos位点间长度合适时，可包装成 $\lambda$ 样颗粒并感染大肠杆菌
    • 因不含 $\lambda$ 噬菌体基因，入胞后仅以质粒形式存在，不能再次形成噬菌体颗粒

黏粒载体克隆基因组DNA

丝状噬菌体载体·

  • M13、f1和fd基因组为约6.4 kb单链环状DNA，共编码11种蛋白质或小肽
  • 经F菌毛感染大肠杆菌；单链DNA先转为双链复制型DNA（RF DNA）
  • M13mp系列在IG区插入 $lacI^q$、lac启动子和含MCS的 $lacZ’$
    • 无外源DNA：发生 $\alpha$ 互补，形成蓝色噬菌斑
    • 插入外源DNA：不能 $\alpha$ 互补，形成白色噬菌斑
  • 复制与装配
    • RF DNA先经数轮 $\theta$ 型复制，再经滚环复制产生单链正链
    • 正链环化后，在穿过质膜的过程中装配成噬菌体颗粒
  • 一般携带300～400 bp外源DNA，片段过长时基因组不稳定
  • 用途：制备单链模板、单链探针、单链测序、定位诱变和噬菌体展示
  • 噬菌体展示时，外源基因经接头与外壳蛋白基因融合，使外源蛋白展示于颗粒表面，可研究蛋白质相互识别，或从展示库选择具有特定功能的蛋白质

主要载体比较·

载体 实例 外源DNA容量 能否装配成颗粒 主要用途
质粒 pBR322、pUC系列、Bluescript M13 $<10$ kb 不能 克隆、表达及一般基因操作与分析
$\lambda$ 噬菌体 Charon、$\lambda gt$ 系列 $<23$ kb 能 基因组文库和cDNA文库
黏粒 pJC、pWE系列 $<49$ kb 能 基因组文库
单链噬菌体 M13mp系列 300～400 bp 能 单链模板/探针、定位诱变、噬菌体展示
  • 教材表35-1将Bluescript M13列入质粒栏；正文则将其归为噬菌粒，可在辅助噬菌体帮助下按噬菌体方式复制和装配

宿主细胞的要求·

  1. 易形成可接受外源DNA的感受态细胞
  2. 无限制酶；教材写宿主防护DNA系统hsd应为 $S-、R-、M^-$
  3. 无重组能力，即 $recA^-$
  4. 易生长、易筛选，且宿主与载体选择标记相匹配
  5. 符合安全标准，通常必须依赖人工培养基，不能在自然界独立生存

外源基因导入宿主细胞·

原核细胞·

  • 转化（transformation）

    将外源DNA导入宿主细胞并改变其遗传性状。

  • 转染（transfection）

    将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞；不同于完整病毒颗粒的感染。

  • CaCl2法
    • 冰冷CaCl2处理使大肠杆菌处于感受态，随后瞬间加热
    • 机制尚未完全明确；教材推测低温下 $Ca^{2+}$ 使质膜变脆，热激形成裂隙，使DNA入胞
  • 电穿孔（electroporation）：以脉冲高压瞬间击穿脂双层，DNA进入后细胞膜再修复
    • 相同电位梯度下，细胞越大，两端电位差越大，越易击穿
    • 动、植物细胞一般需数百伏，细菌需数千伏

$\lambda$ 噬菌体的体外包装·

  • 只要长度合适，重组 $\lambda$ DNA或黏粒DNA均可与外壳蛋白和辅助包装蛋白在体外形成颗粒
  • 效率：每微克重组DNA可形成 $10^9$ 以上pfu，比感受态转化率高 $102～103$ 倍
  • 防止包装蛋白与内源 $\lambda$ DNA装配的方法
    1. 分别制备缺少一种关键包装蛋白的两种提取物，加入外源重组DNA后互补包装
    2. 删除溶原菌中 $\lambda$ 溶原体的cos位点，使单一菌株提取物只能包装外源含cos的DNA

真核细胞·

细胞类型 主要方法与特点
酵母 酶解细胞壁制成原生质体；在CaCl2和PEG存在下摄取DNA，再生细胞壁
动物 磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖/聚阳离子、脂质体、脂质转染、电穿孔、显微注射
植物 原生质体经PEG、磷酸钙或CaCl2处理；也可电穿孔、脂质体、显微注射、Ti质粒或基因枪
  • 动物细胞方法比较
    • 磷酸钙共沉淀：成本低、操作方便，但效率低
    • 脂质转染和电穿孔：效率高，但分别需要昂贵试剂或特殊仪器
    • 显微注射：针头直径0.1～0.5 $\mu$m，可直接注入细胞核，效率极高；但仪器昂贵、操作复杂
  • 植物细胞
    • Ti质粒的T-DNA可携带外源基因进入植物细胞并整合到染色体；土壤杆菌本身不进入细胞
    • 叶盘法：叶盘接种土壤杆菌 → 培养 → 诱导长芽 → 诱导生根 → 移栽
    • 教材指出，土壤杆菌法适用于双子叶植物而不适用于单子叶植物
  • 病毒载体导入效率较高，但应删除毒性基因并防止病毒基因组在细胞内重组
  • 基因枪：使约1 $\mu$m的钨粉或金粉微弹携带DNA，高速轰击靶组织；在植物基因工程中使用较多

基因的分离、合成和测序·

  • 获得目的基因的主要途径
    • 限制酶切割基因组DNA后分离
    • 已知序列时进行化学合成
    • 基因序列已知时用PCR由模板扩增
    • 构建基因组文库或cDNA文库后筛选：无需预先知道完整序列，应用最普遍

基因组文库的构建·

  • 基因组文库（genomic library）

    整套基因组DNA片段插入克隆载体后所得分子克隆的总和；理想情况下应包含该基因组的全部遗传信息。

  • 文库容量

$$ N=\frac{\ln(1-p)}{\ln(1-f)} $$

符号 含义
$N$ 文库中克隆的数目
$p$ 任意目标基因存在于文库的概率，通常要求 $>99%$
$f$ 一个克隆DNA片段大小占基因组大小的比例
  • 教材例：哺乳动物单倍体基因组为 $3\times10^9$ bp，克隆片段为 $2\times10^4$ bp，要使目标基因存在概率 $>99%$，需克隆数 $>6.9\times10^5$

构建步骤·

  1. 染色体DNA片段化
    • 应尽可能随机，使不同片段被克隆的概率相等
    • 机械切割：超声、高速搅拌或通过细针头；真正随机，但后续需分级、补平并接衔接物
    • 限制酶部分消化：连接方便，但切点并非真正随机
    • 识别4 bp的MboI和Sau3A接近随机切割，称为准随机切割（quasi-random cutting）
    • 超出载体容量的片段不能被克隆，因此文库可能丢失部分遗传信息
  2. 制备载体DNA：选择 $\lambda$ 噬菌体或黏粒并切开，获得左、右臂
  3. 体外连接与包装：用T4 DNA连接酶连接基因组片段和载体，再与 $\lambda$ 包装蛋白体外装配
  4. 感染大肠杆菌
    • $\lambda$ 载体在宿主中增殖并裂解，形成噬菌体克隆库
    • 黏粒入胞后仅以质粒复制，故黏粒文库由细菌克隆组成
  5. 鉴定和扩增
    • 测定库容量：噬菌体以pfu表示，不能形成噬菌斑者以cfu表示
    • 随机抽取克隆，以限制酶切、PCR等检查质量
    • 扩增会产生偏倚：不同插入片段影响复制速度，部分克隆可能增加、减少甚至丢失

基因组文库的构建


cDNA文库的构建·

原理与容量·

  • 真核基因含内含子，原核细胞又不能完成其转录后剪接，因此真核基因不能直接在原核细胞表达
  • 成熟mRNA经逆转录形成连续编码序列的cDNA，再接上原核表达控制元件，才可在原核细胞表达
  • mRNA不稳定，因此研究基因表达及细胞中已有mRNA时，常将其转化为cDNA
  • cDNA文库

    一个细胞中全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆后的总和。

比较 基因组文库 cDNA文库
来源 整个基因组DNA 特定细胞、组织和状态下的成熟mRNA
代表内容 理想情况下含全部遗传信息 仅含当时已表达基因的信息
真核内含子 含有 已在mRNA加工中除去
主要用途 获得基因组片段、建库 研究表达谱、获得可在原核表达的连续编码序列
  • 哺乳动物胚胎期mRNA种类约占基因总数30%，分化成熟组织约占10%
  • 高丰度mRNA每种可有几十万拷贝；低丰度mRNA仅有几个或几十个拷贝
  • 低丰度cDNA所需文库容量

$$ N=\frac{\ln(1-p)}{\ln(1-1/n)} $$

  • $p$：低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求 $>99%$
  • $1/n$：每一种低丰度mRNA占总mRNA的比例

mRNA的分离·

  • 高质量mRNA是构建cDNA文库的关键，操作全程必须防止RNase降解
    1. 器皿高温焙烤或以0.1% DEPC洗涤；试剂用DEPC处理水配制，煮沸除去DEPC
    2. 破碎细胞时用强变性剂使RNase失活
    3. 反应中加入RNasin抑制RNase
  • 真核mRNA的 $3’$ 端通常有poly(A)，可用oligo(dT)纤维素或琼脂糖亲和纯化
    • 高盐：poly(A) RNA与oligo(dT)结合
    • 低盐：二者解离，mRNA被洗脱

cDNA的合成·

  • 逆转录酶的共同特点
    • 以RNA为模板合成第一条cDNA链
    • 具有RNase H活性，可水解DNA-RNA杂合分子中的RNA链
    • 可再以第一条cDNA链为模板合成第二条链
    • 以4种dNTP为底物，需要引物，无校对功能
特点 AMV逆转录酶 M-MuLV逆转录酶
多肽链 两条；同一基因编码但翻译后加工不同，A链短于B链 一条
最适温度 42℃ 37℃
最适pH 8.3 7.6
RNase H活性 较强 较弱
  • 第一条cDNA链的常用引物
    • $oligo(dT)_{12～18}$
    • 随机六核苷酸 $(dN)_6$
    • 已知序列时使用与mRNA $3’$ 端互补的特异引物
  • 第一链合成后，用RNase H或碱除去RNA链
第二链合成方法 原理与特点
回折法 第一链自身回折并引发第二链；S1核酸酶切去回折单链；易丢失 $5’$ 端序列，现较少用
取代法 RNase H部分水解RNA，残余RNA片段作引物；DNA聚合酶I合成，需大肠杆菌DNA连接酶和 $NAD^+$ 连接
随机引物法 六核苷酸在第一链上随机引发
均聚物引发法 第一链 $3’$ 端加均聚尾，以互补寡聚物作引物
特异引物法 序列已知时，以特异引物合成第二链

双链cDNA的克隆·

  • cDNA克隆主要使用质粒和 $\lambda$ 噬菌体载体
方法 操作与特点
平端连接 Klenow酶或T4 DNA聚合酶补平两端后与载体连接；效率较低
接头法 接头连接后需限制酶切；应先用相应甲基化酶保护cDNA内部位点
衔接物法 直接提供黏性末端，无需再酶切，也无需预先甲基化
均聚物加尾 cDNA加poly(A)/poly(G)，载体加poly(T)/poly©，退火后转化

  • 改进方法可把衔接物与引物合并，使合成的cDNA直接具有黏性末端；也可把引物接在载体DNA上，使cDNA合成后直接连于载体

  • cDNA文库构建五步

    1. 制备mRNA
    2. 合成cDNA
    3. 制备载体DNA
    4. 克隆双链cDNA
    5. 鉴定文库容量、克隆质量和异质性，必要时适当扩增

  • 两项质量要求

    • 文库应包含各种稀有mRNA的cDNA克隆
    • cDNA应尽可能为全长，避免丢失 $5’$ 端序列

cDNA文库的构建


克隆基因的分离与鉴定·

  • 选择（selection）：依据重组体的特征，直接从文库中挑选目的克隆
  • 筛选（screening）：检查整个文库，从中找出目的克隆
  • 判断依据可来自载体特征、目的基因序列或基因产物

载体表型的直接选择·

标记 选择原理
抗药性 抗性基因使获得载体的细胞能在相应抗生素中生长；也可利用插入失活选择重组体
营养标记 载体基因补足宿主营养缺陷，使其能在不补充相应营养物的培养基中生长
显色标记 外源DNA插入 $lacZ’$ 后菌落呈白色，空载体菌落呈蓝色
噬菌斑 噬菌体载体形成噬菌斑，本身即构成选择
  • $tet^r$ 插入失活的选择实例
    1. 外源DNA插入 $tet^r$，重组体成为 $Tet^s$
    2. 四环素抑制敏感重组体生长；环丝氨酸杀死仍生长的 $Tet^r$ 非重组体
    3. 转移到无两种药物的培养基，保留下来的重组体恢复生长

菌落或噬菌斑原位杂交·

  1. 将平板菌落复印到硝酸纤维素膜或尼龙膜
  2. 用NaOH裂解细胞并使DNA变性
  3. 中和后在80℃烘2 h，使变性DNA固定在膜上
  4. 与标记探针杂交；盐浓度是杂交液的重要因素
  5. 洗去非专一吸附物，烘干并放射自显影
  6. 按底片黑点回到原平板定位阳性菌落，再扩大培养
  7. 分析插入DNA长度、限制酶切图谱和DNA序列等
  • 一张滤膜可筛选约50000个菌落
  • 噬菌斑原位杂交与菌落法相似：滤膜直接接触噬菌斑，使DNA转移到膜上，再经变性、固定、杂交和自显影
  • 杂交通常需十多小时；探针可为与目标序列互补的单链或双链DNA，也可为RNA
  • 探针的选择
    • 目的序列已知：已有克隆、PCR产物或化学合成的寡核苷酸；合成探针一般应 $>16$ nt
    • 仅有其他物种同源基因：用同源序列作探针
    • 仅知蛋白质序列：按密码子简并性合成简并探针，并尽量选择简并度低的区域；简并密码子第三位可混合A、G、C、T，或用I代替
    • 也可利用突变序列或差异表达cDNA
  • 检测可采用放射性标记，也可使探针偶联显色酶或发光物质

原位杂交筛选DNA重组体

差别杂交与消减杂交·

  • 差别杂交（differential hybridization）
    1. 用特异状态A组细胞的mRNA建立cDNA文库
    2. 分别以A组和普通状态B组的mRNA或cDNA作探针
    3. A、B均阳性的克隆为共同表达；A阳性、B阴性者为A组特异表达克隆
  • 缺点：比较费时、灵敏度低，低丰度cDNA常难检出
  • 消减杂交（subtractive hybridization）：先除去两组共有cDNA，再克隆剩余的特异cDNA
    1. 由A组特异细胞mRNA合成第一条cDNA链
    2. 与B组非特异细胞20倍过量mRNA杂交
    3. 通过羟基磷灰石柱；双链核酸被吸附，单链核酸流出
    4. 再分别以50倍和100倍过量B组mRNA重复消减
    5. 剩余特异cDNA与自身mRNA杂交，经柱吸附、洗脱后克隆

消减杂交分离特异cDNA

表达文库筛选·

  • 将真核cDNA或原核染色体DNA片段插入含启动子、SD序列和终止子等元件的原核表达载体，构成表达文库
  • 可按表达产物筛选目的基因
    1. 免疫学方法：以放射性、显色酶或发光物质标记的抗体检测
    2. 功能活性：检测酶促反应、激活或抑制作用、配体与受体结合
    3. 蛋白质结构和性质：相对分子质量、肽谱等

克隆基因的最终鉴定·

  • 首先重复核实以排除假阳性，再从三方面鉴定
    1. 基因结构和序列：限制酶切图谱、分子杂交、测序
    2. 表型特征：抗性、报告基因性状等
    3. 基因产物：抗体反应、肽谱、蛋白质活性等

聚合酶链反应扩增基因·

  • 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）

    DNA的体外酶促扩增，又称无细胞分子克隆法。

  • PCR模拟DNA复制，按三步循环进行
    1. 变性：双链DNA解开
    2. 退火：两条引物分别与模板互补配对
    3. 延伸：DNA聚合酶以4种dNTP为底物，从引物开始合成新链
  • 早期使用Klenow酶，每轮加热后均需补充；耐热的Taq DNA聚合酶使PCR操作成熟
  • 只要能设计目标片段两端的引物，即可扩增相应DNA
    • 正链 $5’$ 端引物：正向、上游、有义链或 $5’$ 引物
    • 与正链 $3’$ 端互补的引物：反向、下游、反义链或 $3’$ 引物
  • 理论产量

$$ Y=(1+X)^n $$

  • $Y$：产量；$X$：扩增效率；$n$：循环次数
  • 扩增效率为60%时，30次循环可扩增约 $1.33\times10^6$ 倍

引物设计·

  1. 长度应 $>16$ nt，一般为20～24 nt
    • $4{16}=4.29\times109$，已大于哺乳动物单倍体基因组约 $3\times10^9$ bp，可减少随机结合
  2. 引物与靶序列间的 $T_m$ 一般不低于55℃
    • 小于30 nt时可估算：

$$ T_m=(G+C)\times4+(A+T)\times2 $$

  1. 不应形成发夹，即不含4 bp以上回文序列
  2. 两引物间不应有大于4 bp的互补或同源序列，且 $3’$ 端不应互补
    • 两引物 $3’$ 端仅有2个互补碱基，即可产生明显引物二聚体
  3. 碱基分布尽可能均匀，$G+C$ 含量接近50%

反应条件·

阶段 常用条件
初始变性 94℃，5～10 min
循环变性 94℃，45 s～1 min
退火 1 min；通常比引物 $T_m$ 低2～3℃，实际最适温度须经实验确定
延伸 72℃，1～1.5 min
循环数 25～30次
末次延伸 延长至10 min
  • 上述时间适合扩增300～500 bp片段；片段更长时应适当延长反应时间
  • 100 $\mu$L反应液约加入2 U Taq DNA聚合酶，模板靶序列通常为1 pg～1 ng
  • Taq DNA聚合酶无校对功能，PCR产物易发生错误；可改用有校对功能的耐热DNA聚合酶

PCR的基本过程

PCR的主要衍生技术·

技术 原理 用途
不对称PCR 两端引物摩尔数不等，如60∶1 制备单链探针或单链模板
RT-PCR RNA先逆转录为cDNA，再进行PCR 检测特异RNA、分析转录产物、构建cDNA库、克隆cDNA等
PCR诱变 在引物中设置错配或附加序列 引入取代、缺失、插入或其他变异
重组PCR 以左端引物、连接引物和右端引物连接两段DNA 不依赖合适的限制位点，避免残留多余序列
反向PCR 已知部分序列的限制片段先环化，在已知区设置反向引物 扩增邻侧未知序列
锅柄PCR 通过接入已知序列并形成锅柄状链内结构 不经片段环化扩增邻侧未知序列
锚定PCR DNA $3’$ 端加均聚尾，以互补寡聚物作另一引物 扩增未知序列
RAPD 以随机引物扩增基因组 比较不同生物基因组的差异
mRNA差异显示 以随机引物分析表达产物 寻找表达基因差异
  • RT-PCR可检测单个或少数细胞中的特异RNA；逆转录和PCR可分开，也可在同一系统中连续完成
    • 还可用于合成cRNA探针和构建RNA高效转录系统
  • PCR诱变引物
    • 错配碱基置于引物中部或 $5’$ 端
    • 错配位点的 $3’$ 侧必须有15个以上配对碱基
    • 中间位点诱变可先设置内部引物，再以外侧引物扩增；教材称为巢式PCR
  • PCR也可检测突变
    • 错配会使杂交分子的 $T_m$ 降低
    • 也可针对特定突变位点设计引物，直接判断是否含突变序列
  • 染色体步移（chromosome walking）：从已知序列出发，重复反向PCR，逐步扩增相邻未知序列
  • 反向PCR与锅柄PCR
    • 反向PCR需使限制片段自身环化
    • 锅柄PCR通过末端处理和接入已知寡核苷酸形成链内二级结构，省去环化步骤，效率较高
  • 也可将一段已知序列与人基因组中分散的Alu序列作为一对引物，扩增未知序列
  • 其他用途
    • 制备Sanger测序样品或进行基因组测序
    • 临床检测肿瘤、遗传病、病原体和进行胎儿早期检查
    • 检测多年残留的痕量DNA，用于刑侦和亲缘关系鉴定

DNA的化学合成·

  • 基本思想
    1. 用保护基封闭核苷酸中暂不反应的活性基团
    2. 激活需要反应的基团
    3. 使一个核苷酸羟基与另一个核苷酸磷酸基形成磷酸二酯键
    4. 按确定方向逐个聚合核苷酸
  • 方法演进
    • 磷酸二酯法：早期方法
    • 磷酸三酯法：保护一个磷酸酸根，减少副反应并提高产率
    • 亚磷酸三酯法：反应更快，并发展为固相自动合成
  • 商用核苷底物的保护
    • A、C碱基氨基：苯甲酰基（Bz）
    • G碱基氨基：异丁酰基（Ib）
    • $5’-OH$：二甲氧三苯甲基（DMT）

每一轮合成的四步反应·

  1. 酸处理，脱去末端保护基
  2. 在四唑催化下活化并缩合，形成亚磷酸三酯
  3. 用乙酸酐封闭未参与偶联的 $5’-OH$，防止其参与以后反应
  4. 用碘氧化亚磷酸三酯，形成较稳定的磷酸三酯
  • 第二步以二异丙基氨基亚磷酰氯甲酯作活化剂和缩合剂
  • 全部合成后以硫酚和三乙胺脱去保护基，并用氨水将全长寡核苷酸从载体上水解下来
  • 产物经HPLC和凝胶电泳纯化、鉴定；每个核苷酸合成循环约需7～10 min

基因定位诱变·

  • 基因定位诱变（site-directed mutagenesis）

    按设计要求，使基因特定序列发生插入、删除、置换或重组等变异。

方法 基本原理
酶切定位诱变 在已有酶切位点切开基因，再插入、删除或置换序列
盒式诱变 用人工合成的变异DNA片段替换两个酶切位点之间的野生型序列
寡核苷酸指导诱变 错配寡核苷酸与单链模板退火并指导突变链合成
PCR诱变 通过引物在DNA两端、内部或多个位置引入变异
  • 若目标位置没有合适的限制位点，可先以寡核苷酸或PCR诱变引入酶切位点
  • 用简并寡核苷酸进行盒式诱变，可一次产生一群随机突变体，再从突变体库中选择

寡核苷酸指导诱变的步骤·

  1. 制备单链模板：把目的基因插入M13 RF双链DNA，转化大肠杆菌并制备重组单链DNA
  2. 合成诱变寡核苷酸
    • 除错配位点外，其余部分均与模板配对
    • 1 nt取代、插入或删除：17～19 nt，错配置于中间
    • 2 nt变异：长度应 $\ge 25$ nt
  3. 退火并合成异源双链DNA
    • 磷酸化引物与模板加热去除二级结构，再缓慢退火
    • Klenow酶或T4 DNA聚合酶合成互补链，DNA连接酶封闭切口
  4. 富集闭环异源双链DNA
    • 以S1核酸酶除去单链M13和未完全合成、封闭的DNA
    • 或用碱性蔗糖密度梯度离心纯化，降低野生型本底
  5. 转染宿主：异源双链DNA复制后产生野生型和突变型两类DNA
  6. 筛选与鉴定
    • 新限制位点：限制酶切筛选
    • 一般突变：较高温度下进行杂交筛选；阳性噬菌斑可能含突变基因
    • 表型明显：生物学方法筛选
    • 最终必须用DNA测序确认

寡核苷酸指导的定位诱变

  • PCR诱变可完成插入、删除、置换和重组；嵌套式PCR还可在基因内部或一次反应的多个位置引入变异

DNA序列测定·

  • 两种经典方法均以高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础，可区分相差1 nt的单链DNA
方法 特点
Maxam-Gilbert化学法 结果较清晰，但操作较费事
Sanger双脱氧链终止法 快速、省事，不需比活性很高的 ${}^{32}P-dNTP$；有时结果不够清晰
  • 自动荧光测序
    • 可用荧光染料标记寡核苷酸引物或ddNTP
    • 电泳分离后由激光激发荧光，光电倍增管捕获信号，CCD获取图像
    • 早期有单染料四泳道和四色单泳道两种方案，教材称后者较流行
    • 毛细管内径50～100 $\mu$m，散热快，可用高电压快速分离
    • 4组反应使用序列相同但荧光标记不同的引物和不同ddNTP，反应后混入同一泳道电泳
    • 能量转移技术可使荧光信号增强3～4倍
  • ddNTP末端标记比引物标记更方便；关键是DNA聚合酶需同样有效地掺入4种荧光ddNTP
    • 教材指出这一难点已基本解决，末端标记结果与引物标记法相差无几

克隆基因的表达·

  • 真核基因通常不连续，且真核、原核表达调控方式不同
  • 真核基因在原核细胞表达时，应使用cDNA并连接原核表达控制元件

外源基因在原核细胞中的表达·

表达控制元件·

  • 目标：建立高水平且可调节的表达系统；强启动子通常设计为可调，以便菌体适度生长后再诱导表达
控制元件 特点
lacUV5启动子 lac启动子经紫外诱变；无需cAMP活化，仍受LacI阻遏；由IPTG诱导
tac启动子 trp启动子 $-35$ 区与lac启动子 $-10$ 区融合；由IPTG诱导
$\lambda P_L/P_R$ 受 $\lambda$ 阻遏蛋白调节；$cIts857$ 在30℃阻遏，超过42℃后阻遏蛋白失活并表达
ompF启动子 受ompR正调节；冷敏感调节蛋白低温无活性，升温后激活；表观效应与 $cIts857$ 相似但机制不同
T7启动子 由T7 RNA聚合酶特异识别并高效转录，适合高效表达或体外转录
  • 核糖体结合位点/SD序列
    • 富含嘌呤，长3～9 nt，位于AUG上游3～11 nt
    • 与16S rRNA $3’$ 端互补
    • 翻译效率还受互补程度、SD与AUG间距及AUG上下游序列影响
  • 终止信号包括转录终止子和翻译终止密码子
    • mRNA过长会浪费底物与能量，并易形成妨碍翻译的二级结构
    • UAA、UAG、UGA中，教材指出UAA终止能力最强

融合蛋白表达·

  • 采用融合表达的原因
    1. 外源蛋白首个残基可能不是Met，而外加起始Met可能影响其活性
    2. 蛋白质N端序列影响合成和折叠；融合宿主高表达蛋白的N端序列可提高表达水平
    3. 融合蛋白较稳定，可减少宿主蛋白酶降解
    4. 某些表位不受融合影响，便于抗体工程
    5. 与特定多肽或蛋白质融合，便于检测和纯化
  • 纯化后常需切除融合部分
切割方式 识别或切割位点
溴化氰 Met
甲酸加热 $-Asp\downarrow Pro-$
羟胺加热 $-Asn\downarrow Gly-$
胰蛋白酶 Arg或Lys
肠激酶 $-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys\downarrow$
$X_a$ 因子 $-Ile-Glu\text{（或Asp）}-Gly-Arg\downarrow$
枯草杆菌蛋白酶Ala64突变体 $-Gly-Ala-His-Arg\downarrow$

  • 只有在外源蛋白内部没有可被胰蛋白酶切割的碱性残基时，才适合在融合处引入Arg或Lys后用胰蛋白酶切割

  • 分泌表达：将外源蛋白与信号肽编码序列融合

    • 信号肽引导新生链进入细菌周质或培养基
    • 信号肽酶切去信号肽，释放活性蛋白

提高外源基因表达水平·

  • 常见障碍
    • 产物错误折叠或不稳定；尤其长度超过100个残基时，易降解或形成包涵体
    • 过量产物可能损伤宿主，部分产物具有毒性
    • 不同外源基因对细胞内外条件的要求不同，未必均能满足
  • 改进措施
    1. 选择高效表达载体，逐项试验启动子、转录起点距离和起始密码子附近序列
    2. 增加表达载体拷贝数
    3. 选用蛋白酶活性低或缺陷的宿主
    4. 提高分子伴侣表达，必要时使其与外源蛋白共表达
    5. 使用宿主偏爱密码子
    6. 采用融合表达
    7. 采用分泌表达
    8. 从包涵体回收蛋白并使其复性
    9. 筛选合适宿主及生长、诱导和发酵条件
  • 构建高产工程菌后，还可继续诱变和选育
  • 外源表达并非宿主的正常生理过程，强调控元件也不保证高表达，各影响因素需分别实验。

原核表达产物的分离和鉴定·

一般流程·

  1. 初步检测
    • 工程菌培养、诱导并收集菌体
    • 悬于2% SDS、0.1 mol/L DTT、0.05 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）
    • 煮沸3 min，除去不溶物后进行SDS-PAGE
    • 以不表达外源基因的菌体蛋白作对照
  2. 确定细胞内分布
    • 溶菌酶去除细胞壁，提取周质蛋白
    • 破碎细胞并离心，区分可溶部分和沉淀部分
  3. 分离纯化
    • 盐析、离子交换层析、亲和层析、分子筛层析、电泳、超滤等
    • 若标签妨碍产物应用，纯化后还需去除标签
  4. 产物鉴定
    • 相对分子质量：SDS-PAGE、HPLC、毛细管电泳、质谱
    • 结构：N端、C端、氨基酸组成、蛋白酶肽谱
    • 功能：生物活性或免疫原性

包涵体的处理·

  • 包涵体（inclusion body）

    外源蛋白高水平表达时形成的、不溶性且以大量折叠不完全产物混有少量其他蛋白的聚集物。

  • 优点
    • 易与其他组分分离
    • 产物免受胞内蛋白酶降解
    • 产物无活性时，不易毒害宿主
  • 缺点：恢复活性困难，常降低最终产量
  • 回收流程
    1. 破碎细胞、离心收集包涵体
    2. 用Triton X100和EDTA洗涤，除去表面杂蛋白；纯度通常可达90%以上
    3. 用5～8 mol/L盐酸胍、6～8 mol/L尿素、SDS、碱性pH或乙腈/丙酮等溶解
    4. 含二硫键时加入还原剂
    5. 经稀释、透析、超滤或分子筛层析逐渐除去变性剂，使蛋白重新折叠
  • 降低蛋白质合成速度、降低培养温度或共表达分子伴侣，均可能减少包涵体并形成可溶蛋白

$His_6$ 标签与金属螯合层析·

  • 多聚组氨酸可结合固定化 $Ni^{2+}$ 或 $Co{2+}$；常用介质为NTA-$Ni{2+}$-琼脂糖
  • $His_6$ 一般连接在蛋白N端或C端
    • 标签与靶蛋白间加入1～2个Gly可增加柔性
    • 也可插入蛋白酶切点，便于纯化后去除标签
  • 靶蛋白结合层析柱并充分洗涤后，以咪唑或EDTA洗脱
    • 咪唑选择性较好
    • EDTA洗脱效率较高，但易带下柱上的 $Ni^{2+}$，需进一步除镍
  • 优点：效率高、容量大、柱体积小、操作方便，镍柱还可回收并重复使用

外源基因在真核细胞中的表达·

  • 常用真核宿主：酵母、昆虫及高等动植物细胞
  • 表达载体通常由质粒、病毒或染色体DNA改造，并含大肠杆菌复制起点，便于先在大肠杆菌中构建和鉴定
  • 真核表达还受转录后加工调节，控制元件比原核系统复杂

酵母表达系统·

  • 酵母的特点
    • 单细胞真核生物，基因组约 $1.2\times10^7$ bp
    • 丰富培养基中世代时间约90 min
    • 约6000个基因，大多已知
    • 是教材所称真核基因工程的首选宿主，有“真核生物的大肠杆菌”之称
酵母载体 关键元件 在酵母细胞中的存在方式
YIP：整合质粒 有选择标记，无酵母复制起点 必须整合入染色体才稳定存在
YEP：附加体质粒 酵母2 $\mu$ 质粒复制起点 高拷贝存在
YRP：复制质粒 染色体自主复制序列ARS 中等拷贝存在
YCP：着丝粒质粒 ARS、CEN 单拷贝且稳定存在
YAC：人工染色体 ARS、CEN、TEL 作为微型染色体，可克隆 $>100$ kb DNA
  • 酵母选择标记常用URA3等生物合成基因，配合营养缺陷型宿主
  • 加入大肠杆菌选择标记和ori，可构成穿梭载体
  • 酵母表达启动子
    • 必须能被RNA聚合酶II识别
类型 实例与调节
可诱导启动子 GAL、PHO5
组成型启动子 ADH1、PGK、GPD
  • GAL1启动子的调节
    • GAL4结合UAS → 激活转录
    • 葡萄糖培养基：GAL80与GAL4形成复合物，阻止启动子活化
    • 半乳糖培养基：GAL80与GAL4解离，GAL4结合UAS并激活转录
  • PHO5启动子
    • 缺无机磷时被活化
    • 富含磷时，PHO80阻止PHO4的激活作用
  • 组成型启动子产生的mRNA可占总mRNA的1%以上，但其活性仍受生理条件影响，在非葡萄糖碳源中较低
  • 提高基因拷贝数可增加表达；mRNA前导序列、 $3’$ 末端形成和腺苷酸化信号也影响效率

酵母克隆载体

植物表达系统·

Ti质粒与T-DNA·
  • 根瘤土壤杆菌可感染裸子植物和双子叶植物，在伤口处附着于细胞壁；其Ti质粒的一段DNA进入植物细胞并整合到染色体，引起冠瘿形成和冠瘿碱合成
  • Ti质粒
    • 双链闭环DNA，约200 kb
    • 相对分子质量为 $90\times106\sim150\times106$
    • 与致瘤有关的主要区域为T区和毒性基因区（vir区）
  • T-DNA
    • 长15～30 kb，约占Ti质粒的 $1/10$
    • 两端为25 bp正向重复，分别为左边界LB和右边界RB
  • T-DNA转移
    1. vir区编码的内切核酸酶在T-DNA两端造成单链切口
    2. 单链T-DNA从Ti质粒脱离
    3. $5’$ 端RB与Vir蛋白共价结合
    4. 在Vir蛋白引导下进入植物细胞核并整合到染色体
  • T-DNA基因只有插入植物染色体后才被激活
T-DNA基因 产物或作用
ocs或nos 分别编码章鱼碱或胭脂碱合成酶
tmr 编码细胞分裂素合成酶；突变后出现大量根增生
tms1、tms2 编码生长素合成酶；任一突变可出现芽增生
  • tmr、tms1和tms2统称致瘤基因onc
Ti质粒载体的改造·
系统 构建原理
二元载体 T-DNA与vir区分置两个载体；小质粒T-DNA删除onc、保留nos并插入外源基因；另一缺失T-DNA的Ti质粒提供Vir蛋白
共整合载体 $onc^-$ Ti质粒与携带外源基因的pBR型质粒通过共有序列同源重组，使外源基因进入T-DNA两边界之间
  • 共整合载体中的 $onc^-$ Ti质粒只保留T-DNA边界和nos，其余部分换入pBR序列，如 $amp^r$
  • 共整合系统中的pBR型质粒还可带有
    • nos启动子驱动的neo，供植物细胞选择
    • $kan^r$，供细菌选择
  • pBR型小质粒自身不能接合转移
    • 转移依赖辅助质粒的tra和mob基因产物
    • pBR质粒上的bom是Mob蛋白结合位点
  • 三亲株配对
    1. 携带辅助转移质粒的大肠杆菌
    2. 携带外源基因给体载体的大肠杆菌
    3. 携带 $onc^-$ Ti衍生受体载体的根瘤土壤杆菌
  • 三者共同培养时，辅助质粒先进入给体宿主，再帮助给体载体转入土壤杆菌；教材称其转移效率较高

Ti质粒载体系统

  • 其他植物载体
    • Ri质粒可诱发毛根；其不定根经培养可再生可育植株
    • CaMV DNA载体的35S启动子广泛用于植物表达
    • TMV为单链RNA病毒，可先逆转录为cDNA，再插入质粒构建载体
  • 植物病毒载体易操作、感染效率高、表达水平高，但一般不整合，外源基因不能通过种子稳定传代

哺乳动物表达系统·

  • 表达载体常由SV40、逆转录病毒和腺病毒等改造
  • 主要功能元件
    1. 原核复制起点和选择标记，常采用pBR型序列
    2. 真核启动子、增强子、转录终止与腺苷酸化信号、剪接信号
    3. 真核细胞中复制和选择所需的遗传因子
SV40载体·
  • SV40为小型二十面体病毒，含约5 kb双链环状DNA
  • 不同宿主中的结果
细胞 感染结果
猿猴CV-1允许细胞 产生感染性颗粒并使细胞裂解
啮齿动物非允许细胞 不产生感染性颗粒；病毒DNA整合，细胞发生转化
人半允许细胞 仅1%～2%细胞产生颗粒，极少发生整合
  • 在允许细胞内，SV40 DNA形成核小体样微小染色体
    • 早期mRNA编码T抗原和t抗原；T抗原启动复制，t抗原功能尚不清楚
    • 晚期mRNA编码外壳蛋白VP1、VP2和VP3
  • 两类SV40载体
    • 取代型重组病毒载体：外源基因等量取代部分病毒基因；仍可包装，但缺失功能需辅助病毒或辅助细胞补充
    • 重组病毒质粒载体：将SV40复制起点插入大肠杆菌质粒，在COS细胞中利用T抗原大量复制
  • 取代型载体的互补包装
    • 常用晚期基因取代载体；辅助病毒tsA58在41℃时T抗原失活且不再合成，但仍能合成外壳蛋白
    • 重组病毒提供T抗原，使重组病毒和tsA58均能复制、包装
    • 早期基因取代载体则由COS细胞提供T抗原
  • COS细胞由复制起点失活的SV40早期区段转化CV-1而成，可组成型表达T抗原
  • 两类载体均只能短期存在并作瞬时表达，因为病毒感染或复制失控最终使宿主细胞裂解
逆转录病毒载体·
  • 逆转录病毒为致瘤RNA病毒，病毒RNA经逆转录形成原病毒DNA
  • 原病毒DNA的基本结构
    • 两端为LTR
    • $5’$ 端附近有结合tRNA引物的PBS和包装位点 $\psi$
    • $3’$ 端附近有PPT，可作为正链DNA合成引物
    • 编码基因为gag、pol、env，并含剪接位点
  • 构建时将原病毒DNA插入pBR322，删除gag、pol、env的大部分或全部序列，加入外源基因和选择标记
    • 常用标记：neo、gpt、dhfr
  • 辅助病毒超感染可产生假型包装颗粒
    • 具有感染所需的全部蛋白质
    • 其中基因组RNA来自重组体DNA的转录产物
  • 也可把包装缺陷的原病毒DNA整合进宿主，建立辅助细胞以代替辅助病毒
  • 教材指出，逆转录病毒载体产量高，转移成功率几乎可达100%；LTR可控制整合和表达，使外源基因持久表达
病毒载体 主要特点
逆转录病毒 整合和表达效率高，但只能转染正在分裂的细胞
腺病毒 容量较大，可转染非分裂细胞
痘病毒 可用于构建工程疫苗

转基因植物和转基因动物·

  • 1972年，外源基因被插入SV40 DNA，构建出首个DNA重组体
  • 1982年，转基因植物和转基因动物均获得成功
    • Ti质粒使章鱼碱合成酶基因在烟草再生植株中表达
    • 大鼠生长激素基因显微注射入小鼠受精卵，培育出体型增大的转基因小鼠
  • 即DNA重组技术诞生约10年后，植物和动物转基因均获成功

获得转基因植物·

  • 植物细胞全能性：分化的植物细胞在一定条件下仍可脱分化、再分化并形成完整植株
  • 胚性悬浮细胞、胚性愈伤组织或叶盘转化所得组织均可经激素诱导生根、生芽，获得再生植株

选择标记与报告基因·

  • 转化率通常较低，需用选择剂从大量细胞中选出获得外源DNA的转化子
  • 选择标记基因（selectable marker gene）
    • 抗性基因：编码使抗生素或除草剂失活的酶，植物细胞中最常用
    • 营养性基因
  • 报告基因（reporter gene）

    用于判断外源DNA是否导入，并检测其表达水平的基因。

  • 标记基因有时可兼作报告基因，反之亦然
基因 编码产物与选择原理 注意点
neo 新霉素磷酸转移酶NPT使新霉素、卡那霉素和G418失活 某些单子叶植物天然抗性较高，不宜用neo筛选
bar 膦丝菌素乙酰转移酶使除草剂膦丝菌素失活 膦丝菌素抑制谷氨酰胺合成酶，使非转化细胞积氨并在10～20 d内死亡
GFP 绿色荧光蛋白吸收蓝光后产生绿色荧光 可直接在活体内检测，教材认为使用最方便
LUC 荧光素酶在ATP存在下氧化荧光素并发光 发光需要底物和ATP
GUS、CAT 催化呈色或抗性反应 可用于分析外源基因表达及调控元件
  • 报告基因还可用于研究启动子、增强子、顺式元件、反式因子和蛋白质相互作用

酵母双杂交·

  • 用途：以已知蛋白X从cDNA文库中寻找与之相互作用的未知蛋白Y
  • 转录激活蛋白通常含DNA结合结构域（DNA-BD）和激活结构域（AD）
    1. 已知蛋白X与DNA-BD融合，形成BD-X诱饵（bait）蛋白
    2. 未知蛋白Y与AD融合，形成AD-Y猎物（prey）蛋白
    3. BD-X结合报告基因上游UAS
    4. 若X与Y相互作用，AD-Y被带至UAS附近并激活报告基因
    5. 若二者不相互作用，报告基因不表达或仅弱表达

转基因植物再生·

愈伤组织培养·
  • 愈伤组织：植物伤口形成的一团软薄壁细胞
  • 新鲜愈伤组织置于含营养物和植物激素的培养基，可维持未分化状态并继续分裂
  • 改变植物生长素与细胞分裂素比例可诱导分化
    • 生长素/细胞分裂素比值高 → 生根
    • 细胞分裂素/生长素比值高 → 生芽
  • 植株再生（regeneration）：由愈伤组织培养并分化形成完整可育植株
  • 再分化还受培养时间、湿度、光强、pH、物种和外植体来源影响；并非所有植物或愈伤组织都能再生
原生质体培养·
  • 纤维素酶和果胶酶消化细胞壁，在等渗培养液中释放原生质体
  • 原生质体易经磷酸钙、阳离子脂质、PEG或电穿孔导入外源DNA
  • 不同物种原生质体可发生融合，使远缘植物染色体重组成为可能
  • 叶肉组织最常用：易分离，再生能力较强
  • 原生质体培养数日后重建细胞壁并分裂；饲养层技术可促进单细胞生长
  • 悬浮培养物或愈伤组织保存过久
    • 丧失再生能力
    • 还会发生有丝分裂异常，产生多倍体、非整倍体和染色体畸形
花粉培养·
  • 可获得单倍体原生质体、愈伤组织和单倍体植株
  • 单倍体育种的优点
    • 周期短
    • 仅有一套基因，无显性、隐性之分，便于突变体分离和基因作用分析
    • 便于分析表达调节元件和调节因子
  • 单倍体不能有性生殖；用秋水仙碱等处理形成纯二倍体后，可进行有性生殖

外源基因在植株中的表达·

表达类型 特点
组成型 持家基因等持续表达
封闭型 异染色质中的基因始终封闭
特异型 仅在特定组织、发育阶段或光照、温度、重金属等条件下表达
  • 获得理想转基因植株的三个环节
    1. 构建表达载体
    2. 筛选转化细胞
    3. 培育转基因植株
  • 常用启动子
启动子 特点
CaMV 35S 单、双子叶植物均可使用，但在单子叶植物中较弱
水稻Act1、玉米Ubi 单子叶植物常用
组织特异启动子 只在特定组织表达；如花粉绒毡层启动子指导RNase表达，可产生雄性不育作物
  • 诱导型启动子
    • A型：响应脱落酸、生长素、赤霉素、细胞分裂素、系统素等植物激素
    • B型：响应高温、低温、水涝、盐渍、重金属等环境因素
    • C型：响应抗生素或化学药剂等人工化合物
  • 常用终止子：CaMV 35S终止子、nos终止子
  • 改善表达的方式
    • 串联同一启动子，或融合不同启动子
    • 改变启动子和非编码区序列
    • 插入高表达基因的内含子1和外显子1
    • 采用受体植物偏爱密码子
    • 添加蛋白质定位信号

转基因沉默·

  • 转基因沉默/失活：外源基因表达很弱或不表达
  • 共遏制（cosuppression）：转基因沉默时，植株自身的同源基因也同时受抑
类型 机制
转录水平基因沉默（TGS） 转基因DNA甲基化和异染色质化，使转录受到抑制
转录后基因沉默（PTGS） 转基因mRNA翻译受抑或被降解
  • 主要成因
    • 随机整合到重复序列或异染色质区内或附近 → 位置效应 → DNA甲基化和异染色质化
    • 多拷贝串联整合 → 转录RNA回折形成双链RNA → RNA干扰
  • 减轻方法
    • 在外源基因两侧加入MAR/SAR，使其与核基质结合并形成DNA突环，阻断邻近序列的影响
    • 借助选择标记和报告基因筛出高效表达细胞，淘汰部分沉默细胞

获得转基因哺乳动物·

  • 与植物的主要差别
    • 动物细胞无细胞壁，但也不具有植物细胞式全能性
    • 转基因体细胞株不能直接再生为成年个体
    • 动物细胞核具有全套遗传信息；体细胞核移入去核的受精卵后可在一定程度上返回未分化状态

选择标记·

  • 哺乳动物载体可由病毒改造，也可由质粒加入真核表达元件形成
  • 常用导入方法：病毒感染、磷酸钙、脂质体、电击和显微注射
  • 选择标记必须与相应选择系统配套
标记基因 选择或检测原理
tk BUdR经TK作用后掺入DNA，使 $TK^+$ 细胞对UV敏感；HAT培养基则淘汰 $TK^-$，保留携带tk的细胞
抗MTX的dhfr 使细胞可在氨甲蝶呤中生存
cat 真核细胞本身无CAT；测定CAT活性可定量反映外源基因表达
xgprt 在麦可酚酸、氨基蝶呤并补充黄嘌呤和腺嘌呤时，使细胞能合成GMP并生存
neo NPT使G418失活，是哺乳动物培养细胞的常用标记

哺乳动物细胞的基因组编辑·

  • 基因打靶（gene targeting）：导入的外源基因与核内目标基因发生同源重组，使外源序列定点整合
    • 敲除（knock-out）：使目标基因失活
    • 敲入（knock-in）：以正常基因矫正目标基因突变，或定点改变序列
  • 同源序列应 $>25$ bp，越长打靶效率越高；教材称长达14 kb时效率最高
  • 打靶载体应线性化，并使两端分别为目标基因两侧的同源序列
  • 敲减（knock-down）：借RNA干扰降低而非彻底消除基因表达
    • 回文序列表达shRNA，经Dicer加工形成siRNA
    • miRNA和其他调节RNA也可导入细胞调节目标基因
特异切割基因组的核酸酶·
技术 靶序列识别方式 主要特点
ZFN 锌指蛋白的DNA结合结构域 两亚基结合后才有核酸酶活性；每个锌指识别3～4 bp
TALEN TAL效应物识别DNA 二聚体；较易设计，效率高，脱靶作用远低于ZFN
CRISPR-Cas 向导RNA与DNA互补配对 RNA指导核酸酶，识别能力高，适用范围广
  • ZFN切割后可通过两类途径修复
    • 非同源末端连接（NHEJ）：频率高，但易引入突变
    • 有同源序列时发生同源定向修复（HDR）
  • ZFN的局限：锌指识别能力较差，并非所有基因都有合适锌指，效率较低且脱靶危害较大
  • TALEN与ZFN使用相同核酸酶，用法相近；教材表述TALEN中一个氨基酸对应两个碱基
CRISPR-Cas系统·
  • CRISPR-Cas本是细菌抵抗外源DNA的防御系统
  • 基因座包括CRISPR序列和Cas基因
    • CRISPR：前导序列、短回文重复序列和间隔序列
    • Cas基因：编码DNA切割酶
  • 天然作用过程
    1. 细菌获取一小段入侵DNA，插入CRISPR间隔区
    2. CRISPR转录形成pre-crRNA
    3. pre-crRNA与tracrRNA结合并经加工形成成熟crRNA
    4. crRNA含入侵DNA序列，可识别对应外源DNA
    5. crRNA-Cas复合物特异切割外源DNA
  • 工程化系统产生Cas9和gRNA
    • gRNA $5’$ 端含20 nt识别序列
    • Cas9的HNH结构域切割互补链，RuvC结构域切割另一条链
    • 双链断裂可用于基因敲除、敲入和修复
  • 可用于细菌、真菌及各类动植物基因组改造；教材称其为近十年来基因工程最重大的技术突破之一

CRISPR-Cas切割外源DNA

获得转基因个体·

  • 获得哺乳动物个体需将外源基因导入生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞
  • 病毒载体感染局部组织或体外编辑细胞再回输，可用于基因治疗，但不能直接由体细胞株再生完整个体
受精卵显微注射·
  1. 受精后1 h内，雄、雌前核尚未融合；雄性前核较大，较易显微操作
  2. 注入已删除原核载体序列的线性DNA
  3. 先使代孕雌性与切断输精管的雄性交配，再将一般25～40个受精卵移入其子宫
  4. 后代出生后逐一鉴定和筛选
  • 并非所有胚胎都能发育，也并非所有幼子均转基因成功
  • 教材指出，该法已用于多类实验动物、家畜、家禽和鱼类，技术上已经成熟
胚胎干细胞法·
  1. 从早期胚泡分离具有全能性的胚胎干细胞（ES细胞）
  2. 导入外源基因，筛选在正确位点整合且表达良好的细胞
  3. 将转基因ES细胞放回胚泡，再移入代孕母体
  4. 获得嵌合体；经多代选择、培育和交配，得到纯合转基因动物
有缺陷线粒体的置换·
  • 子代线粒体来自母体卵细胞；母体线粒体DNA缺陷可通过胞质置换处理
  • 将母体卵细胞核移入线粒体正常的去核卵细胞，再进行受精和孕育
  • “三亲线粒体”：核基因来自父母双方，另一女性提供线粒体DNA

基因工程的安全性·

  • 1975年Asilomar会议的共识

    重组DNA可带来巨大利益，也存在极大风险，必须实行严格的安全管理。

  • 1976年，美国NIH发布重组DNA研究准则；我国于1990年发布重组DNA工作安全管理条例
  • 安全问题分为三个层次
    1. 实验室操作安全
    2. 产业生产安全
    3. 产品安全

实验室操作安全·

  • 潜在生物危害
    1. 有害细菌和病毒
    2. 癌基因和其他致病基因
    3. 环境污染和生态平衡破坏
  • 基本要求
    • 涉及有害基因时，载体必须无转移能力，宿主不能离开实验室生存
    • 严格无菌操作；转基因细胞须高压灭菌后才可洗涤、排放
    • 按风险设置物理防护
等级 适用范围 主要防护
P1 一般重组DNA操作 普通实验室无菌操作；产物和菌种高压灭菌后废弃
P2 可能有害但不严重的操作 可灭菌的负压无菌操作箱；空气过滤，套筒操作
P3 有害基因和病原体操作 整个实验室可灭菌、保持负压、空气过滤，人员经缓冲室进出
P4 高危病原体操作 独立建筑和隔离带；沐浴更衣、正压防护服、实验室负压，空气、水和物品特殊处理

产业生产安全·

  • 五项重点
    1. 防止转基因生物扩散
    2. 防止目标基因、选择标记和报告基因等重组基因扩散
    3. 集中处理转基因生物废弃物
    4. 防止环境污染
    5. 防止破坏生态平衡
  • 主要措施
    • 农田设置隔离带和不接受转基因花粉的缓冲作物；养殖场设置隔离墙
    • 严格隔离和消毒，防止外源病毒促成重组基因再重组、包装和逃逸
    • 集中处理全部废弃物
  • 教材所述观察
    • 各类抗性基因已有不同程度扩散；抗生素选择压力和抗性基因扩散均可提高环境微生物抗性
    • 抗虫和抗除草剂基因也有扩散，并有“超级杂草”的报道
    • 迄今尚无转基因生物破坏地球生态平衡的报道
    • 广泛使用Bt基因未见鳞翅目昆虫及食虫鸟类种类、数量减少，也未发现有关昆虫和杂草进化速度异常
  • 生态影响具有长期性，现阶段未发现异常并不代表无需警惕，仍须持续监测和研究

转基因食品安全·

  • 上市前必须完成动物试验；上市后仍需监测，并符合一般食品质量标准和转基因食品规格
  • 安全要求
    1. 不得残留有潜在危害的基因DNA，一般转基因DNA残留量也受严格限制
    2. 不得含过敏原或易引起过敏反应的表位
    3. 持续观察对免疫力的影响
    4. 持续观察对生殖力和遗传的长期影响
    5. 标明转入的基因，保障食用者知情权和选择权
  • 巴西坚果蛋白基因转入大豆后曾导致过敏，该转基因大豆被停止使用
  • 关于转基因玉米、马铃薯使大鼠体重和免疫力下降的报道，复查认为动物数不足且缺乏严格对照，不足以得出结论；但免疫影响仍是观察重点

教材的总体结论：发展转基因食品是趋势，加强安全管理是关键。

蛋白质工程·

  • 蛋白质工程

    按照特定需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。

  • 自然蛋白质适应生物自身需要，却未必适合产业应用，因此需进行定向改造

蛋白质的分子设计和改造·

  • 蛋白质工程依赖多学科知识，尤其需要蛋白质结构规律和系统数据库
  • 分子设计的主要依据
    1. 蛋白质分子间的进化关系
    2. 一级结构与空间结构的关系
    3. 蛋白质结构与功能的关系
  • 计算机技术用于结构分析、三维结构预测、模型构建、分子设计和能量计算，是定向改造的重要手段
  • 典型工作循环
    1. 根据结构与功能关系进行分子设计
    2. 借基因工程获得突变蛋白质（mutein）
    3. 检验是否达到预期性能
    4. 效果不理想时重新设计、改造，常需多轮反复

蛋白质的实验进化·

  • 理性设计的局限
    • 许多成果仍偏重理论或技术，真正获得性能改进的实用蛋白质并不多
    • 主要原因是分子设计不够精确；目前对结构规律认识有限，对一级结构改变后空间结构和功能的预测并不可靠
  • 实验进化

    在实验室模拟生物分子的进化，通过随机变异和目标功能选择的多轮循环，获得性能改进的蛋白质。

  • 达尔文式循环：变异 → 选择 → 增殖
    • 巨大的随机突变体库是获得有益变异的基础
    • 选择具有方向性
    • 增殖使被选择的突变体保存下来

易错PCR与DNA混编·

  • 易错PCR（error-prone PCR）
    • Taq DNA聚合酶无校对功能，核苷酸掺入错误率约 $2\times10^{-4}$
    • 30个循环后错误率可达0.25%
    • 提高dNTP浓度并加入 $Mn^{2+}$ 或 $Co^{2+}$，错误率可提高到2%
    • 变异率过高会使分子群丢失有用信息
  • DNA混编（DNA shuffling）：体外基因重组技术，可增加异质性，使有害变异与有益变异分离并组合有益变异
    1. 随机片段化：在 $Mn^{2+}$ 存在下用DNase I部分消化，获得平端或近平端片段
    2. 自身引发PCR：重叠片段互补的 $3’$ 端配对并相互引发延伸，逐渐形成全长基因
    3. 重组合PCR：以基因 $5’$、$3’$ 端引物扩增重组后的全长基因

DNA混编

噬菌体展示与选择·

  • 噬菌体展示把外源蛋白表型与其编码基因偶联，选择到蛋白质的同时也选择到相应基因
  • 常用M13或噬菌粒为载体
    • gp8：主要小外壳蛋白
    • gp3：尾部低拷贝外壳蛋白，每颗粒约3～5个，可识别大肠杆菌性纤毛
    • 二者N端均暴露，可与外源蛋白融合展示
  • 融合蛋白可能影响外壳蛋白功能，因此采用双拷贝基因
    • 一个拷贝保持野生型
    • 一个拷贝与外源基因融合
  • 噬菌粒单链DNA的产生和装配依赖辅助噬菌体
  • 选择方式
    • 正选择：挑选有益突变
    • 负选择：淘汰有害突变
    • 亲和淘选（affinity panning）：固定选择剂，吸附高亲和力的突变蛋白，是最简单、常用的方法

噬菌体表面展示与特异选择


蛋白质工程的进展·

  • 两大用途
    1. 为蛋白质及其基因研究提供手段
    2. 改进基因工程产品并开发新用途
  • 研究方面
    • 解析蛋白质结构并总结结构规律
    • 确定蛋白质间相互作用及有关氨基酸残基
    • 阐明结构与功能关系、活性部位及关键残基作用
  • 药物改造目标
    • 提高活性、特异性和稳定性
    • 控制分子聚集
    • 降低免疫原性和毒副作用
    • 延长体内半寿期
    • 增强对靶位点的导向性

改造实例·

  • 水蛭素HV2
    • 将Asn47改为Lys，使其可与Thr4或Asp5形成氢键，帮助N端肽段正确取向
    • 体外抗凝效率提高4倍，动物模型抗血栓效果提高20倍
  • 人重组生长激素
    • 与催乳激素受体结合需 $Zn^{2+}$，与生长激素受体结合不需 $Zn^{2+}$
    • 置换参与锌配位的His18、His21、Glu174，尝试降低与催乳激素受体的结合
    • 实验结果符合设想，但教材明确指出距临床用药仍需大量研究
  • 工业酶
    • 已分离并进行生物化学研究的酶不下数千种，但用于工业生产的仅数十种，开发潜力很大
    • 提高热稳定性可通过引入二硫键、置换不稳定残基、增加内部疏水残基实现
    • 枯草杆菌蛋白酶突变型1E2A含V93I、N109S、N181D和N218S
    • 与野生型等量DNA混编回交时，每个突变以 $1/2$ 的概率进入改组群体
    • 筛选后中性突变占50%，不利突变全部被排除；再将N218S与N181D组合
      • 65℃半衰期提高近10倍
      • 变性温度提高6.5℃
      • 比活提高2倍以上

基因工程的应用与展望·

对生物学研究的影响·

  • 基因工程使基因分离、测序、表达和功能研究显著加快，并可大量制备生物体内微量蛋白质
  • 反向生物学（inverse biology）

    先分离、克隆、测序和表达基因，再研究其功能；顺序与传统“性状→蛋白质→基因”的研究途径相反。

  • 基因工程推动结构分子生物学、发育分子生物学、神经分子生物学和分子医学等领域发展

人类基因组计划与组学·

  • 教材所列人类基因组数据
    • 23对染色体
    • 单倍体基因组约 $3\times10^9$ bp
    • 约3万个基因
  • 人类基因组计划
    • 1986年R. Dulbecco提出
    • 原计划1990—2005年实施15年，投资30亿美元
    • 六国科学家参与；2000年6月完成草图，2003年提前完成全序列测定
  • 后基因组研究的三个层次
    • 语言信息：测定全序列
    • 语义信息：明确全部编码基因的功能
    • 语用信息：阐明基因表达的时空调节
  • 研究对象由单个分子扩展到分子群体
    • 1994年提出蛋白质组概念；蛋白质组学研究细胞全部蛋白质的存在及活动方式
    • 1997年提出转录物组学，1999年提出RNA组学
    • 糖组学、脂类组学、代谢组学等

生物技术产业·

  • 生物技术以基因重组技术为核心，还包括酶技术、细胞技术、微生物发酵技术、生化工程、生物模拟和生物信息技术

基因工程药物·

  • 1977年生长素释放抑制激素的工程表达
    • 14肽基因与 $\beta$-半乳糖苷酶基因融合，置于pBR322的lac启动子控制下
    • 产物经溴化氰切割Met后释放14肽
    • 1 L发酵液可得50 mg，相当于50万头羊下丘脑的提取量
  • 后续实例：胰岛素原、人生长素、人白细胞干扰素、口蹄疫抗原疫苗和酵母表达的乙肝抗原疫苗等
  • 抗体的三代
代次 来源
第一代 免疫动物获得的抗体
第二代 杂交瘤产生的单克隆抗体
第三代 抗体工程产生的抗体
  • 噬菌体抗体库可在体外进行克隆选择，无需免疫动物

农业应用·

  • 转基因可使作物获得抗病毒、抗病菌、抗虫、抗除草剂、抗寒、抗涝、抗旱和抗盐碱等性状
  • 还可调节生长发育、缩短生长期，提高产量，改善品质、营养和保存性
  • 转基因动物可获得高产、优质、抗病和短生长期等性状
  • 植物的茎、根、种子，禽蛋和哺乳动物乳汁可作为生物反应器，生产药物或疫苗
  • 提高作物光合作用效率及直接利用空气氮源是教材所述展望，并非既成成果

基因治疗·

  • 基因治疗（gene therapy）

    向受体细胞引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因缺陷；也可利用导入基因杀死病原体或恶性细胞。

  • 教材所列实例
    • 1990年：将ada导入SCID患儿淋巴细胞并回输，症状明显缓解
    • 1991年：我国首例B型血友病基因治疗获得满意结果
  • 教材同时强调：基因治疗技术尚未成熟，许多试验并未成功
  • 三个关键问题
    1. 选择有效的治疗基因
    2. 构建安全载体；病毒载体效率高，但有潜在危险
    3. 定向导入靶细胞并获得高表达
  • 免疫基因治疗的优点
    • 可较长期持续产生治疗量的疫苗或抗体蛋白
    • 易控制表达，也可定点注射
    • 可按患者疾病制备特异基因，实现个体化治疗
  • 重要风险：引入基因在补偿缺陷时还可能引起其他反应，甚至抑制体内正常基因表达
  • 体外编辑淋巴细胞或干细胞后再回输，可能是有效途径；教材称其在皮肤癌、乳腺癌治疗中已取得较好结果
  • 反义RNA和RNA干扰已开始临床试用
    • RNA制剂不稳定，其化学衍生物又常有毒
    • 因此可导入编码反义RNA或干扰RNA的基因，使其在体内表达产生RNA
  • 遗传病、肿瘤等疾病可望受益，以及基因疫苗、基因抗体和RNA基因制剂的应用，均是教材提出的展望，不应视为已经普遍实现

研究展望·

  • 基因工程推动生物科学进入三个相互关联的发展方向
    1. 技术创新使研究速度显著提高
    2. 生物科学与工程学结合，形成有组织的大科学工程
    3. 从认识和利用生物，走向在分子水平设计新的基因、蛋白质和生物新品种
  • 发育研究
    • 基因标签或基因敲除可使发育停留在有关基因控制的阶段，用于克隆发育基因
    • 发育程序由一系列基因相互作用逐步展开
    • 果蝇发育调控呈层次网络：原初基因 → 分节基因 → 同源异形基因
    • 教材仅“估计”同源异形基因产物是一类转录因子，发育机制仍远未完全阐明
  • 神经研究
    • 多种离子通道和神经递质受体基因已被克隆，可经表达获得足量蛋白并在体外研究
    • 学习可能使突触连接发生长期变化；教材把基因表达改变与长期记忆、第二信使信号与短期记忆联系起来
  • 生物技术产业已涉及药物、食品、化工产品、生物材料、优良品种，以及诊断、医疗保健、水净化和废物处理等
  • “再过二三十年，生物经济可能成熟、取代信息经济并成为领头产业”属于教材的预测，而非当前事实

本章名词·

限制性内切核酸酶｜restriction endonuclease　⭐真题

限制性内切核酸酶是一类存在于细菌中、能识别并水解外源DNA的内切核酸酶。它可特异识别DNA上的特定序列，并在识别位点或附近切割，产生黏性末端或平末端，是基因工程中用于切割DNA的关键工具酶。

原位杂交｜in situ hybridization, ISH　⭐真题

是用标记的核酸探针, 经放射自显影或非放射检测体系, 在组织、细胞及染色体水平上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常分为 RNA 原位杂交和染色体原位杂交两大类。

聚合酶链反应｜polymerase chain reaction　⭐真题

聚合酶链反应是DNA的体外酶促扩增技术，又称无细胞分子克隆法。其基本原理是模拟体内DNA复制，通过反复的变性、退火和延伸循环，使DNA以指数方式扩增。该技术使用耐热的Taq DNA聚合酶，并需设计目标片段两端的特异引物，可从微量样品中快速扩增任意DNA片段。

启动子｜promoter

是一段位于结构基因 5’ 端上游区的 DNA 序列, 能活化 RNA 聚合酶, 使之与模板 DNA 准确地相结合并具有转录起始的特异性, 对于基因转录起始是所必需, 是基因表达调控的上游顺式作用元件之一。

基因文库｜cDNA 或 genomic DNA libraries

是某一生物体全部或部分基因的集合。将某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当载体在体外重组后, 转化宿主细胞, 所得的菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。

沉默子｜silencer

沉默子是与增强子功能相反的顺式作用元件，通常位于基因的上游或下游，能与特异性蛋白因子结合，抑制转录活性，从而负调控基因表达。

cDNA文库｜cDNA library

cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。它以细胞中提取的mRNA为模板，经逆转录酶催化合成互补DNA，再转化为双链cDNA并连接到载体中，从而构建包含不同表达基因对应cDNA克隆的集合。cDNA文库主要用于分离特定cDNA克隆或研究细胞的基因表达谱，特别适用于真核生物，因其基因断裂，只有成熟mRNA逆转录的cDNA才能在原核生物中表达。

根瘤土壤杆菌｜Agrobacterium tumefaciens

根瘤土壤杆菌是一种能诱发裸子植物和双子叶植物产生冠瘿的病原菌。它携带一种称为Ti质粒的双链闭环大质粒，该质粒上的T-DNA区段可在感染时转移并整合到植物染色体DNA中，导致植物细胞形成肿瘤并合成冠瘿碱。基于这一特性，根瘤土壤杆菌的Ti质粒已被改造为植物基因工程中广泛使用的克隆载体。

基因打靶技术｜gene targeting

基因打靶技术是一种通过同源重组将外源基因定点整合到细胞基因组，以实现基因敲除或敲入的基因编辑技术。其核心是外源打靶基因与内源目标基因间通过同源序列发生同源重组，从而定点修饰遗传性状。该技术可导致靶基因失活（敲除）或用正常基因矫正突变（敲入），常用于基因功能研究和基因治疗。

基因治疗｜gene therapy

基因治疗是将具有治疗价值的基因,即“治疗基因”装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中,导入人体细胞,通过靶基因的表达来治疗遗传疾病。基因治疗是从根本上治疗遗传病的唯一途径。目前科学界关注的主要问题是基因治疗的有效性、安全

Ti质粒｜Ti plasmid

Ti质粒是根瘤土壤杆菌中存在的双链闭环DNA质粒，大小约200 kb，能诱发寄主植物产生冠瘿瘤。其上的T-DNA区段（约15~30 kb）在毒性区（vir）协助下可转移并整合到植物染色体中，导致肿瘤形成和冠瘿碱合成。Ti质粒已被改造为植物基因工程的重要克隆载体。

突变型｜mutant

突变型是指带有突变基因并表现出相应表型的生物个体或细胞。通常通过与野生型比较来识别，其基因序列发生改变，可能导致蛋白质功能异常。

新霉素｜neomycin

新霉素是一种由弗氏链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，能与原核生物核糖体的30S亚基结合，阻止蛋白质合成起始复合物的形成，并可引起密码子错读，从而抑制细菌蛋白质合成。在基因工程中，常利用新霉素磷酸转移酶基因（neo）作为选择标记，该酶通过磷酸化作用使新霉素失活，赋予宿主细胞抗性。

野生型｜wild type

野生型指自然界中常见的、未经过人工诱变的基因型或表型，通常作为遗传学实验的标准对照。

叶盘转化法｜leaf disc transformation

叶盘转化法是一种常用于植物基因工程的转基因方法，利用打孔器从叶片上取下盘状圆片，接种土壤杆菌后共培养，再依次通过长芽培养基和生根培养基诱导叶盘分化出芽和根，最终获得可移栽的转化植株。

引物结合位点｜primer binding site

引物结合位点（primer binding site, PBS）是逆转录病毒RNA基因组5′端附近的一段保守序列，能够与宿主细胞的特定tRNA互补配对，该tRNA作为逆转录起始的引物，在逆转录酶催化下启动负链DNA的合成。

猿猴空泡病毒｜Simian virus 40

猿猴空泡病毒40（SV40）是一种小型二十面体病毒，基因组为长约5 kb的双链环状DNA。它感染猿猴细胞（如CV-1）时产生感染性病毒颗粒并导致细胞裂解，此类细胞称为允许细胞；而感染啮齿动物细胞则病毒DNA整合到宿主基因组引起细胞转化，为非允许细胞。SV40常用于改造为哺乳动物基因工程的表达载体。

载体｜vector

能将外源 DNA 或基因片段携带入宿主细

表达载体｜expression vector

表达载体是在宿主细胞中表达外源基因的克隆载体，通过在基因两侧插入启动子、终止子等调控序列，实现高效转录和翻译。常选用强而可调节的启动子（如lac、tac、λPL等），并可携带选择标记基因和蛋白标签，便于转化子筛选和表达产物的检测与纯化。

表面蛋白｜surface protein

表面蛋白是指定位于细胞质膜外表面的蛋白质分子，通常以跨膜或糖基磷脂酰肌醇锚等形式与膜相连。它们常被糖基化修饰为糖蛋白，其寡糖链能作为凝集素等分子的特异性识别位点。表面蛋白广泛参与细胞识别、黏附、信号转导和免疫应答等关键生物学过程。

表面排斥蛋白｜surface exclusion protein

表面排斥蛋白是指在细菌接合过程中，由特定质粒（如F质粒）编码并定位于细胞表面的蛋白质。其主要功能是阻止携带相同或相近质粒的供体菌之间发生接合配对，从而避免无效的遗传物质转移和能量消耗，确保接合仅发生在供体菌与受体菌之间。

差别杂交法｜differential hybridization

差别杂交法是一种用于分离不同细胞或状态下差异表达基因的技术。通过构建目的细胞的cDNA文库，分别用两种细胞的mRNA或cDNA作为探针进行原位杂交筛选，比较杂交信号差异，获得仅在一种细胞中特异表达的基因克隆。该方法可直接筛选出与特定性状相关的基因，但操作费时、灵敏度低，难以检测低丰度基因。

半纤维素酶｜hemicellulase

半纤维素酶是一类能够催化半纤维素水解的酶，主要包括木聚糖酶、甘露聚糖酶等，它们可分解植物细胞壁中的半纤维素成分，在植物细胞壁降解等过程中发挥重要作用。

半允许细胞｜semi-permissive cell

半允许细胞（semi-permissive cell）是指对猿猴空泡病毒40（SV40）感染呈部分许可的细胞类型，例如人体细胞。病毒感染后，仅有1%~2%的细胞能产生感染性病毒颗粒，多数细胞不支持病毒完整复制。这一特性介于完全支持病毒复制并裂解的允许细胞和完全不产生感染性颗粒的非允许细胞之间。

包涵体｜inclusion body

包涵体（inclusion body）是蛋白质在细菌中高水平表达时形成的不溶性颗粒，主要由大量折叠不完全的产物蛋白与少量其他蛋白质聚集而成。

报告基因｜reporter gene

报告基因是用于判断外源DNA是否成功导入宿主细胞并检测其表达水平的基因，通常编码能产生荧光的蛋白或催化呈色反应、抗性反应的酶。这类基因便于在转化后识别和定量分析外源基因的导入与表达情况，有时也可兼作选择标记基因。

巢式PCR｜nested PCR

巢式PCR是一种在DNA片段中间设置引物以引入变异的PCR技术。通过内侧引物在目标位点引入所需变异，再以外侧引物进行延伸扩增，可在基因内部或一次PCR中多处实现插入、删除、置换等定位诱变。

穿梭质粒｜shuttle plasmid

穿梭质粒是指含有原核生物和真核生物两种复制起点及相应选择标记的质粒载体，能在原核细胞（如大肠杆菌）和真核细胞（如哺乳动物细胞）中稳定复制和存在，便于基因克隆与表达操作。典型穿梭质粒常以pBR型质粒序列为基础提供原核复制起点和抗性标记，并携带真核表达控制元件。

次氮基三乙酸镍-琼脂糖｜Ni-NTA agarose

次氮基三乙酸镍-琼脂糖（Ni-NTA agarose）是一种用于亲和层析的固定化金属离子亲和层析介质，由琼脂糖共价连接次氮基三乙酸（NTA）并螯合镍离子（Ni²⁺）构成。它能够特异性结合带有多聚组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白质，利用组氨酸残基的咪唑侧链与镍离子形成配位键而吸附。洗脱时通常使用含咪唑或EDTA的缓冲液竞争性置换靶蛋白，实现纯化分离。

重组PCR｜recombinant PCR

重组PCR是指通过PCR技术将不同的DNA序列片段连接在一起的方法。该技术利用引物设计使扩增片段末端具有互补序列，进而通过重叠延伸实现片段的融合，在基因工程操作中非常有用。

重组病毒质粒载体｜recombinant viral plasmid vector

重组病毒质粒载体是以动物病毒（如逆转录病毒）基因组为基础，将其DNA插入大肠杆菌质粒（如pBR322）而构建的复合型载体。构建时通常删除病毒的大部分致病基因（如gag、pol、env），加入选择标记（如neo）和外源基因，并保留病毒包装等必需元件。该载体兼具原核质粒的复制起点和选择标记，可在原核细胞中扩增，同时含有真核表达控制元件，能在哺乳动物细胞中高效表达外源基因，是基因转移与表达研究的重要工具。

重组合PCR｜recombinant PCR

重组PCR是一种通过PCR将不同DNA序列片段连接在一起的技术，在基因工程操作中十分有用。

多接头｜polylinker

多接头，亦称多克隆位点（MCS），是位于克隆载体（如pUC系列）lacZ’基因靠近5’端的一段人工合成DNA序列，密集排列着多种限制性内切酶的单一识别位点，便于将外源DNA片段通过酶切连接定向插入载体，是基因工程中构建重组DNA的关键元件。

发根土壤杆菌｜Agrobacterium rhizogenes

发根土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）是一种能够侵染植物并诱导产生发根（hairy root）的土壤杆菌，与根瘤土壤杆菌同属，其致病机制涉及将自身Ri质粒上的T-DNA转移并整合到植物基因组中，常用于植物基因工程和次生代谢物生产。

感染｜infection

感染是指病毒等病原体侵入宿主细胞，利用宿主细胞体系进行复制和增殖的过程。在允许细胞中，感染可产生感染性病毒颗粒并导致细胞裂解；在非允许细胞中，病毒基因组可能整合入宿主DNA，引起细胞转化。

反相柱｜reverse phase column

反相柱是高效液相色谱中常用的固定相，其内填充疏水介质，通过样品分子与固定相之间的疏水相互作用实现分离。

反向PCR｜inverse PCR

反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧未知序列的PCR方法。它先将DNA用限制性内切酶酶切并自连成环，再以环化DNA为模板，利用已知序列区设计向外延伸的引物进行扩增，从而获取侧翼未知序列。

根性肿瘤｜radical tumor

根性肿瘤通常指由根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染植物创伤部位后，通过将其Ti质粒上的T-DNA整合到植物染色体中，诱导植物细胞异常增殖而形成的冠瘿（crown gall）肿瘤。该肿瘤能大量合成和分泌冠瘿碱，为细菌提供营养。其形成依赖于Ti质粒的T-区段和vir区段的协同作用。

共聚焦显微镜｜confocal microscope

共聚焦显微镜（confocal microscope）是一种利用点照明和空间针孔滤除离焦散射光的光学显微镜，可对样品进行逐点扫描并获取高分辨率、高对比度的光学切片，常用于三维成像和荧光分析。

共整合载体｜co-integrate vector

共整合载体是一类植物基因工程载体，由中间载体与修饰的Ti质粒通过同源重组形成共整合质粒，从而将外源基因整合到T-DNA区域，借助农杆菌介导实现植物转化。

非允许细胞｜nonpermissive cell

非允许细胞是指不支持病毒完成裂解周期、不产生感染性病毒颗粒的宿主细胞。以SV40病毒为例，其感染猿猴细胞（允许细胞）可产生感染性颗粒并裂解细胞，但感染啮齿动物细胞则不产生感染性颗粒，病毒DNA整合到宿主基因组中，导致细胞转化和癌变，这类啮齿动物细胞即为非允许细胞。

干细胞｜stem cell

干细胞是哺乳动物发育过程中保持较低分化水平、具有进一步分化为功能细胞潜能的细胞，如造血干细胞、皮肤干细胞和神经干细胞等。在基因治疗中，可取出干细胞在体外编辑后回输体内以补偿缺陷基因；在转基因动物制备中，可通过对胚胎干细胞进行基因操作培育嵌合体。

分泌粒｜secretory granule

分泌粒是细胞内由膜包被的、储存待分泌蛋白或其他生物活性物质的小泡。它在调节型分泌途径中形成，在未受刺激时在细胞质中积聚，当细胞接受特定信号后，可与质膜融合并以胞吐方式将内容物释放到胞外。

故障-安全系统｜fail-safe system

故障-安全系统是一种在部分组件发生故障时能自动进入或维持安全状态的设计原则。在基因工程中，为防止重组DNA或转基因生物意外释放造成危害，常将载体和宿主设计为无法在实验室外生存或转移，如宿主依赖人工条件、载体丧失自主转移能力，从而在操作失误时系统失效但不产生风险。

分子克隆｜molecular cloning

分子克隆是指在体外将目的基因或DNA片段与载体DNA连接形成重组体，导入宿主细胞后通过宿主的复制系统进行扩增，从而获得大量相同DNA拷贝的技术。其关键步骤包括DNA重组、转化宿主细胞、筛选阳性克隆及扩增，是实现基因分离、扩增和操作的基础方法。

寡核苷酸指导的诱变｜oligonucleotide-directed mutagenesis

寡核苷酸指导的诱变是一种基因定位诱变技术，利用化学合成的含有预定错配碱基的寡核苷酸作为引物，与单链DNA模板退火并延伸，形成异源双链DNA，经转染宿主细胞后通过复制获得突变基因。该技术可在基因的特定位点引入核苷酸置换、插入或缺失等变异，是实现基因定向改造和功能研究的重要手段。

冠瘿｜crown gall

冠瘿是由根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）诱发裸子植物和双子叶植物产生的一种肿瘤。病原菌在植物创伤部位侵入，将其Ti质粒上的一段DNA（T-DNA）转移并整合到植物细胞染色体DNA中，导致植物细胞异常增殖形成肿瘤。冠瘿组织能大量合成和分泌冠瘿碱，为细菌提供营养。

冠瘿碱合成酶基因｜opine synthase gene

冠瘿碱合成酶基因是存在于根瘤土壤杆菌Ti质粒上的基因，负责编码冠瘿碱合成酶。该基因位于T-DNA区段，随T-DNA转移并整合到植物细胞染色体后，可指导植物细胞大量合成冠瘿碱，为根瘤土壤杆菌提供营养。

锅柄PCR｜panhandle PCR

锅柄PCR是一种用于扩增已知序列旁侧未知序列的PCR技术。它先在双链cDNA两端加上多聚尾，再用含有与多聚尾互补序列及已知序列特异引物的复合引物进行扩增，形成类似锅柄的茎环结构，从而将未知区域包含在扩增范围内。

果胶酶｜pectinase

果胶酶是一类能分解果胶的酶，在植物原生质体培养中常与纤维素酶配合使用以消化细胞壁，从而释放出无壁的原生质体。

核苷酸插入｜nucleotide insertion

核苷酸插入是指在DNA或RNA序列中额外增加一个或多个核苷酸的过程。它可通过寡核苷酸指导的诱变等技术人工引入，也见于RNA编辑中插入U、C、A等碱基，或由嵌入染料等诱变剂导致复制时发生。这种插入若发生在编码区，常引起移码突变，导致下游密码子读框改变，进而影响蛋白质功能。

核酸酶S1｜nuclease S1

核酸酶S1是一种特异性降解单链核酸的内切核酸酶，可水解单链DNA或RNA生成5’-磷酸末端的寡核苷酸或单核苷酸，对双链核酸无作用，常用于cDNA合成中切除发夹结构及核酸结构分析。

互补的DNA｜complementary DNA

互补的DNA（cDNA）是指通过逆转录酶催化，以RNA为模板合成的与其序列互补的DNA链。它常用于基因工程中，作为真核基因克隆时的无内含子模板，便于在原核系统中表达。

花粉绒毡层特异启动子｜tapetum-specific promoter

花粉绒毡层特异启动子是一类在植物花药绒毡层组织中特异性驱动基因表达的调控序列，属于特异型启动子，其活性局限于特定的组织、发育阶段或条件，从而实现外源基因的时空特异性表达。

黄单胞杆菌｜Xanthomonas

黄单胞杆菌（Xanthomonas）是一类革兰氏阴性细菌，属于黄单胞菌属，多为植物病原菌，可引起多种植物病害。

invitro｜in vitro

in vitro 指在生物体外的人工环境中（如试管、培养皿）进行的实验研究，与体内研究（in vivo）相对，常用于在可控条件下观察生化反应或分子相互作用。

invivo｜in vivo

in vivo（体内）是指在完整生物体内进行的研究或实验，与体外或细胞水平的研究相对。该术语源于拉丁语，意为“在体内”，强调生物分子、细胞或组织在活体整体生理环境下的功能与相互作用。

基本启动子｜basal promoter

基本启动子是RNA聚合酶Ⅱ启动子中的一种核心控制元件，通常位于转录起始位点上游-25至-30区域，为一长约7 bp的保守序列，其共有序列称为TATA框。它作为启动子的基础组成部分，为转录因子提供识别位点，在转录起始复合物组装中起关键作用。

基因枪｜gene gun

基因枪是一种将外源DNA导入细胞的技术，利用高速金属微粒（如钨或金粉）包裹DNA，通过物理加速穿透细胞壁和细胞膜，将DNA送入细胞内，常用于植物基因工程和基因治疗研究。

基因敲低｜gene knockdown

基因敲低是指通过RNA干扰等技术，特异性降低目标基因表达水平的一种实验手段。与基因敲除不同，敲低只能部分抑制基因功能，而不能彻底消除其性状表现，因此也称为基因敲减。该技术常用于功能基因组学研究，通过观察表型变化来推断基因功能。

酵母附加体质粒｜yeast episomal plasmid

酵母附加体质粒(yeast episomal plasmid, YEP)是酵母克隆载体的一种，含有可选择遗传标记和酵母2μ质粒的复制起点，因而能在酵母细胞内自主复制，并以高拷贝数稳定存在。

酵母复制质粒｜yeast replicating plasmid

酵母复制质粒（yeast replicating plasmid, YRP）是酵母细胞的一类克隆载体，含有酵母染色体DNA的自主复制序列（autonomous replicating sequence, ARS），使其能在酵母细胞内自主复制，并以中等拷贝数存在。

酵母配对型｜yeast mating type

酵母配对型是指决定酵母细胞交配能力的遗传类型，通常由MAT基因座决定，分为a型和α型等，控制信息素的产生和识别，从而调控有性生殖过程中的细胞融合。

酵母人工染色体｜Yeast Artificial Chromosome, YAC

含有三种必需成分: 着丝粒、端粒和复制起点, 是迄今容量最大的克隆载体, 插入片段平均长度为 200~1000 千碱基对, 最大的可以达到 2 百万碱基对。

酵母整合质粒｜yeast integrating plasmid

酵母整合质粒（yeast integrating plasmid, YIP）是一种含有选择标记但缺乏酵母复制起点的酵母克隆载体，必须整合到酵母染色体中才能随着细胞分裂稳定遗传，因此常用于基因整合和稳定表达研究。

酵母着丝粒质粒｜CEN

酵母着丝粒质粒（CEN plasmid）是含有酵母染色体着丝粒序列的酵母克隆载体，使其在细胞分裂时能像染色体一样稳定分配至子细胞，通常以低拷贝数存在。

金属硫蛋白｜metallothionein

金属硫蛋白是一类富含半胱氨酸、低分子量的金属结合蛋白质，能够通过其大量巯基与锌、铜等金属离子结合，参与金属离子稳态调节、解毒及抗氧化应激等生理过程。

茎瘿｜stem gall

茎瘿（stem gall）是植物茎部因病原物（如细菌、真菌）或昆虫寄生等因素刺激而产生的瘤状或异常增生结构。其形成常涉及寄主细胞分裂与分化异常，形态和成因与冠瘿类似，但发生于茎干而非根颈部位。

均聚物引发法｜homopolymer initiation method

均聚物引发法是一种合成 cDNA 第二条链的方法。该方法利用末端转移酶和一种 dNTP 在 cDNA 第一条链的 3’ 端加上均聚物尾巴，然后以与该均聚物尾巴配对的寡聚物为引物，合成第二条链。

菌落形成单位｜colony-forming unit

菌落形成单位（colony-forming unit）是微生物学中用于估计样品中活菌数量的计数单位。它代表在固体培养基上由一个或多个活菌增殖形成的单个菌落。通过计数平板上的菌落数再乘以稀释倍数，可推算出原始样品中的活菌浓度。该方法基于每个活菌在适宜条件下能独立生长为可见菌落的假设，常用于细菌、酵母等微生物的活菌计数。

Klenow片段｜Klenow fragment

Klenow片段(Klenow fragment)是大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶水解后产生的大片段,保留5’→3’聚合酶活性和3’→5’校对外切酶活性,但缺失5’→3’外切酶活性,常用于双链cDNA末端填平补齐等分子生物学操作。

卡那霉素激酶｜kanamycin kinase

卡那霉素激酶（kanamycin kinase），又称新霉素磷酸转移酶，是由大肠杆菌转座子Tn5上的neo基因编码的一种酶。它能通过磷酸化作用使氨基糖苷类抗生素（如卡那霉素、新霉素）失活，因此常作为选择标记基因用于基因工程中筛选转化子。

凯伦｜Charon

凯伦（Charon）是一类由λ噬菌体衍生而来的克隆载体，常用于构建基因组文库，可容纳较大的外源DNA片段。

柯斯质粒｜cosmid

柯斯质粒(cosmid)是一类人工构建的克隆载体，由质粒与λ噬菌体的cos序列融合而成，兼具质粒和噬菌体两者的特性。它含有质粒的复制起点和选择标记，并带有λ噬菌体的cos粘性末端，可被包装入噬菌体颗粒。柯斯质粒的克隆容量约为35～45 kb，适用于大片段DNA的构建与扩增。

克隆选择学说｜clonal selection theory

克隆选择学说是解释适应性免疫中抗体特异性和免疫记忆的核心理论，认为机体存在大量不同特异性的淋巴细胞克隆，每个克隆表面携带单一类型的抗原受体；抗原进入后，仅选择性地与表达相应受体的淋巴细胞结合，触发其增殖分化为浆细胞和记忆细胞，从而产生大量相同抗体并赋予免疫记忆，禁忌克隆的消除则解释自身耐受。

扩增｜amplification

扩增是指使特定DNA序列的拷贝数大量增加的过程。在细胞内，基因扩增是细胞短期内大量产生某一基因拷贝以适应特殊需要的一种调控方式。在体外，PCR技术模拟体内DNA复制，通过变性、退火、延伸的循环使DNA以指数方式扩增，可用于任意DNA片段的快速扩增。

磷酸钙共沉淀法｜calcium phosphate co-precipitation method

磷酸钙共沉淀法是将氯化钙、DNA和磷酸缓冲液混合，使钙离子与磷酸根离子形成不溶性磷酸钙沉淀，并将DNA共沉淀在其中。该沉淀沉积于细胞质膜上，可能通过吞噬作用被细胞吸收，从而将外源DNA导入动物细胞。

绿色荧光蛋白｜green fluorescent protein

绿色荧光蛋白是一种能发出绿色荧光的蛋白质，常用作报告基因，用于检测外源基因在宿主细胞中的表达水平和定位。

氯化铯密度梯度离心｜cesium chloride density gradient centrifugation

氯化铯密度梯度离心是一种利用氯化铯溶液在离心力作用下形成连续密度梯度，从而根据生物大分子（如DNA、RNA等）的浮力密度差异进行分离的超速离心技术。该技术常用于纯化闭环质粒DNA或区分不同构象的核酸分子。

氯霉素乙酰转移酶｜chloramphenicol acetyltransferase

氯霉素乙酰转移酶是一类催化乙酰基从乙酰辅酶A转移到氯霉素上的酶，通过乙酰化修饰使氯霉素失活，从而赋予宿主抗氯霉素表型；其基因常作为选择标记基因用于转基因细胞的筛选，可与相应的选择系统配套使用。

锚定PCR｜anchored PCR

锚定PCR是一种用于扩增一端序列未知的DNA片段的PCR技术，通过在一侧引物上添加已知序列的锚定接头，使得仅有一条特异性引物即可扩增未知区域。该方法常用于获取已知序列的侧翼未知序列或构建cDNA文库时扩增全长序列。

莫洛尼鼠白血病病毒｜Moloney murine leukemia virus

莫洛尼鼠白血病病毒是一种致癌RNA病毒，属于逆转录病毒。其编码的逆转录酶在重组DNA技术中用于以RNA为模板合成cDNA，该酶由一条多肽链组成，最适反应温度为37℃，具有较弱的RNase H活性。

尼龙膜｜nylon membrane

尼龙膜是一种在分子生物学实验中用于固定核酸的固相支持材料。在细菌菌落原位杂交等操作中，可将菌落转印至尼龙膜上，经NaOH处理使菌体裂解、DNA变性并吸附固定于膜表面，进而用于特异性探针杂交检测。

黏粒｜cosmid

黏粒是一种由质粒和λ噬菌体的cos位点组装而成的克隆载体，兼具质粒和噬菌体的特征，可用于克隆较大片段的外源DNA，并能通过噬菌体包装机制高效导入宿主细胞。

黏性末端｜sticky ends

黏性末端是指在重组DNA技术中，由限制性内切酶切割DNA后产生的带有单链突出的末端。这种末端可通过碱基互补配对，使不同DNA片段之间较易进行连接，常用于将平端转变为黏性末端以提高连接效率。

pol基因｜pol gene

pol基因是逆转录病毒基因组中编码聚合酶（Pol）蛋白的基因，通常表达为一个大的前体蛋白，经加工产生逆转录酶、整合酶等酶活性，在病毒复制周期中负责将病毒RNA逆转录为DNA并整合到宿主基因组中。

胚状体｜embryoid

胚状体是指在植物组织培养中，由体细胞或愈伤组织分化形成的类似合子胚的结构，具有胚根、胚芽等器官原基，能够直接发育成完整植株，体现了植物细胞全能性。

栖热水生菌｜Thermus aquaticus

栖热水生菌（Thermus aquaticus）是一种嗜热细菌，1988年Saiki等人从中分离出耐热的DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶，该酶耐高温，在PCR技术中取代了不耐热的Klenow酶，使PCR得以自动化并广泛应用。

嵌合体｜chimera

嵌合体（chimera）是指由基因型不同的细胞或组织构成的生物个体。在转基因动物培育中，常通过将转基因胚胎干细胞注射入正常胚泡，使其参与胚胎发育，形成部分细胞携带外源基因、部分细胞为野生型的嵌合体。这种个体可用于后续繁殖以获得纯合的转基因动物。

敲除｜knockout

敲除是一种通过同源重组使目标基因失活的基因打靶技术。当外源打靶基因与内源目标基因存在同源序列时，导入的外源基因与目标基因发生同源重组，从而定点整合并破坏目标基因功能。与仅降低基因表达水平的敲减不同，敲除可彻底排除该基因的表型。

敲减｜knockdown

敲减是指通过RNA干扰等技术（如siRNA）降低靶基因表达水平，但不完全消除其功能的基因沉默方法，与基因敲除不同，它仅下调基因表达，不能彻底排除基因表现的性状。

敲入｜knockin

敲入（knock-in）是一种基于同源重组的基因打靶技术，通过将外源功能基因定点整合到细胞基因组中，以修正突变或引入特定序列。其核心是导入的外源打靶基因与内源目标基因之间的同源序列配对并发生重组，实现精准替换或插入。该技术常用正常基因矫正目标基因突变，也可用于检测序列改变的效果，是哺乳动物细胞基因组编辑的重要工具。

切割｜cleavage

切割是指由核酸酶催化、在核酸（DNA或RNA）链的特定部位断开磷酸二酯键的过程。它是基因工程中定点修饰基因组的关键步骤，也是细胞修复受损DNA时切除损伤片段的基础反应。

切割酶｜cleavage enzyme

切割酶是一类能识别并切断核酸分子内部磷酸二酯键的酶，主要包括内切核酸酶和具有催化功能的RNA（核酶）。这类酶可在特异序列位点切割DNA或RNA，产生特定末端，是基因工程和基因组编辑中定点剪切核酸的关键工具。

取代型重组病毒载体｜replacement-type recombinant viral vector

取代型重组病毒载体是指通过将外源基因取代病毒基因组中部分非必需序列而构建的重组病毒载体，它能携带外源基因并借助病毒感染能力导入宿主细胞进行表达。

噬菌粒｜phagemid

噬菌粒是一种兼有质粒和丝状噬菌体复制起点的克隆载体，既可作为质粒在大肠杆菌中双链复制，又能在辅助噬菌体存在时产生单链DNA并包装成噬菌体颗粒，常用于DNA测序和定点诱变。

噬菌体Mu｜bacteriophage Mu

噬菌体Mu是一种以DNA为遗传物质的温和性大肠杆菌噬菌体，其命名源于“mutator”（增变基因），因其基因组能以转座方式随机插入宿主染色体而引起突变。它通过复制性转座进行扩增，并在裂解周期中利用宿主的复制机制。Mu噬菌体常作为工具用于细菌遗传学研究，如基因定位和转座子标签。

噬菌体P1｜bacteriophage P1

噬菌体P1是大肠杆菌的一种温和噬菌体，作为克隆载体可容纳较大外源DNA片段（约85-100 kb），常用于构建基因组文库，其转移可通过体外包装完成。

SV40T抗原｜SV40 T antigen

SV40 T抗原是猿猴空泡病毒40（SV40）编码的一种肿瘤抗原，参与病毒DNA复制和宿主细胞转化调控。

三亲株配对｜triparental mating

三亲株配对是将三种不同细菌菌株共培养，利用接合作用实现质粒转移的遗传学技术。通常涉及供体菌（携带待转移质粒）、辅助菌（提供接合转移功能）和受体菌。通过辅助质粒介导，供体质粒被动员并转移至受体菌，从而完成基因重组或载体构建。该技术广泛应用于植物基因工程中，例如将中间载体导入根瘤土壤杆菌。

瞬时表达｜transient expression

瞬时表达是指外源基因导入细胞后，在未整合到宿主基因组的情况下，短时间内进行的转录和翻译，产生相应蛋白质的过程。导入的基因通常随细胞分裂而丢失，表达持续时间较短。该技术常用于快速检测基因功能或重组蛋白的初步鉴定。

筛选｜screening

筛选（screening）是从基因文库中通过逐一检测各重组体克隆，以找出含有目的基因的重组体的方法。与直接根据载体表型特征挑选重组体的“选择”不同，筛选需对整个文库进行系统排查。常用的筛选手段包括利用核酸探针进行原位杂交、通过差别杂交或消减杂交分离差异表达基因等，最终从大量克隆中鉴定出目标克隆。

饲养层技术｜feeder layer technique

饲养层技术是利用经射线或丝裂霉素C处理而失去增殖能力的饲养层细胞，为共培养的靶细胞提供必要的生长因子、细胞外基质和附着环境，以支持其生长、维持特性或促进分化的体外培养方法。该技术广泛应用于胚胎干细胞和诱导多能干细胞的培养，有助于保持细胞的多能性状态。

随机扩增多态DNA｜random amplified polymorphic DNA

随机扩增多态DNA（RAPD）是一种基于PCR的分子标记技术，利用随机短引物对基因组DNA进行扩增，通过检测扩增产物的多态性来反映基因组的多态性，常用于遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定等。

随机引物法｜random priming

随机引物法是以六核苷酸随机引物（dN6）为引物，在逆转录酶催化下合成cDNA第一条链的方法。随机引物与RNA模板的多个位点互补结合并起始逆转录，可合成覆盖整个RNA的cDNA片段，适用于无poly(A)尾或含二级结构的RNA。

生物危害｜biohazard

生物危害（biohazard）是指在重组DNA等实验室操作中所涉及的潜在风险，主要包括有害细菌和病毒、癌基因等致病基因以及可能造成的环境污染和生态平衡破坏。为防止生物危害事件，要求重组DNA的载体和宿主确保安全，不发生从实验室逃逸，并根据危害程度设定P1至P4四个物理防护等级。

同裂酶｜isoschizomer

同裂酶是指识别相同DNA序列但可能具有不同切割位点或切割方式的限制性内切酶，它们可从不同物种中分离得到，在基因工程中可用于产生不同的末端以利于DNA片段的重组。

同尾酶｜isocaudomer

同尾酶(isocaudomer)是指识别不同DNA序列但切割后能产生相同黏性末端的限制性内切酶。这类酶切割DNA后产生的片段具有相同的单链突出端,可以彼此通过碱基互补配对连接,但连接后的杂合位点通常不能再被原先任何一种同尾酶识别切割。

脱靶｜off-target

在基因组编辑中，脱靶指基因编辑工具（如CRISPR-Cas9）在非目标基因位点产生非预期的切割或修饰，可能导致基因突变、功能异常等风险。

外壳蛋白质｜coat protein

外壳蛋白是噬菌体Qβ的主要结构蛋白，构成正二十面体衣壳，包裹并保护病毒RNA。它由病毒RNA编码，基因位于成熟蛋白基因之后、复制酶β亚基基因之前；其N端氨基酸序列与通读产生的次要组分A₁蛋白一致。

外膜蛋白｜outer membrane protein

外膜蛋白是定位于细胞外膜（如革兰氏阴性细菌的外膜）的蛋白质，常见类型包括孔蛋白和脂蛋白，参与物质跨膜运输、维持膜结构完整性及信号转导等功能。

位置效应｜position effect

位置效应是指基因的表达水平或其表型效应因其在染色体或基因组中所处位置不同而发生改变的现象，常由邻近染色质状态、调控元件或异染色质扩散等因素引起，是表观遗传调控的重要体现。

无菌操作箱｜aseptic cabinet

无菌操作箱是一种提供局部无菌环境的实验设备，常用于需避免微生物污染的操作，如微生物接种、基因工程中重组DNA的无菌处理等。其通过物理隔离和空气过滤等方式维持内部空间的无菌状态，确保实验材料不受外界杂菌干扰，保障操作安全性与实验准确性。

无性繁殖系｜clone

无性繁殖系是由单个祖先通过无性繁殖方式产生的遗传组成完全相同的细胞或生物群体。在重组DNA技术中，常指将重组DNA导入宿主细胞后，经筛选和繁殖获得的含有同一目的DNA片段的大量相同拷贝的细胞群体，从而得以扩增和纯化目的基因。

物理防护｜physical containment

物理防护（physical containment）是指重组 DNA 实验室中通过特定构造与设备实现的物理隔离措施，旨在防止有害基因和重组生物体从实验室逃逸，保障操作安全。根据潜在生物危害风险的大小，物理防护分为 P1 至 P4 四个等级，P1 为一般重组 DNA 操作的基本无菌环境，P4 则针对最高风险的研究。

新霉素磷酸转移酶｜neomycin phosphotransferase

新霉素磷酸转移酶（neomycin phosphotransferase，NPT）是由neo基因编码的一种酶，也称卡那霉素激酶。该酶通过磷酸化作用使氨基糖苷类抗生素（如新霉素、卡那霉素、G418）失活，从而赋予宿主细胞对这些抗生素的抗性。因此，其编码基因neo常被用作基因工程中的选择标记基因，以筛选成功导入外源DNA的转化细胞。

衔接蛋白｜adaptor protein

衔接蛋白是一类在信号转导中起分子接头作用的蛋白质，其自身不具有酶活性，但含有特定的结构域（如SH2、SH3等），可介导蛋白质与蛋白质之间的相互作用。它通过同时结合上游和下游信号分子，组装信号复合物，从而将胞外信号传递至胞内效应器，是信号转导途径中的关键连接蛋白。

衔接物｜adaptor

衔接物（adaptor）是指在信号转导途径中，能够连接上游信号分子与下游效应分子的一类蛋白质。它们通常含有多个相互作用结构域，可同时结合不同的信号组分，从而介导信号复合体的组装和信号的传递。衔接物本身通常缺乏酶活性，其主要功能是作为支架促进蛋白-蛋白相互作用，确保信号转导的特异性和效率。

显微注射法｜microinjection

显微注射法是一种借助显微操作仪将外源DNA直接注射入真核细胞的方法。该技术常用于获得转基因动物，尤其适用于将线性化外源基因注入受精卵的雄性前核，注射的最佳时机在受精后一小时内，此时雄性前核较大，易于操作。显微注射需逐个细胞进行，但对生殖细胞、胚胎干细胞和受精卵等细胞的基因导入十分有效。

选择｜selection

选择是根据特定性状或标记从群体中区分并保留所需个体的过程。在分子克隆中，常利用载体上的选择标记基因（如抗性基因、报告基因）结合选择剂筛选转化子，或通过插入失活等策略鉴别重组体。在进化层面，自然选择作用于表型适应性，但分子水平多数突变呈选择中性，其命运主要由遗传漂变而非选择决定。

选择标记基因｜selectable marker gene

选择标记基因是重组DNA技术中用于筛选和鉴定转化子的基因，通常与选择系统配套使用。它主要包括抗性基因和营养性基因，前者编码能使抗生素或除草剂失活的酶，使宿主细胞获得相应抗性；后者可补偿宿主细胞的营养缺陷，从而使成功导入外源DNA的细胞在选择培养基中存活。

选择性基因｜selectable gene

选择性基因是指在重组DNA技术中作为选择标记的基因，通常整合于载体上，赋予宿主细胞特定的表型（如抗生素抗性、营养标记或显色反应），以便在选择性条件下高效鉴别和分离获得重组体的阳性克隆。

相容末端｜compatible ends

相容末端是指DNA分子经限制性内切酶切割后产生的单链突出端，由于碱基序列互补而能彼此配对并连接的末端，通常由相同的限制酶或能产生相同突出序列的不同限制酶切割形成，便于DNA片段在体外重组时高效连接。

消减杂交｜subtractive hybridization

消减杂交是一种用于分离差异表达基因的方法，通过用一般细胞的mRNA与待研究特殊细胞的cDNA进行杂交，去除两者共有的cDNA序列，从而富集特殊细胞特有的cDNA。为提高消减效率，常采用过量mRNA进行多次杂交，确保充分去除共有序列。未杂交的特异cDNA可与自身mRNA再杂交，利用羟基磷灰石柱吸附双链核酸的特性分离，随后洗脱并克隆，获得与细胞特征相关的特异基因克隆。

芽性肿瘤｜blastoma

blastoma（芽性肿瘤）是一类来源于器官或组织胚胎期成芽细胞的恶性肿瘤，常见于婴幼儿和儿童。肿瘤细胞分化程度低，增殖活跃，形态类似发育早期原始组织。典型例子包括肾母细胞瘤、神经母细胞瘤和肝母细胞瘤等。

硝酸纤维素滤膜｜nitrocellulose filter

硝酸纤维素滤膜是一种在分子生物学技术中用于核酸转移和固定的薄膜材料。在细菌菌落或噬菌斑的原位杂交中，可将平皿上的菌落复印到该膜上，经NaOH处理使菌体裂解、DNA变性并释放，DNA随后被固定于膜上，用于后续的特异性探针杂交和检测。

异源双链｜heteroduplex

异源双链（heteroduplex）是由两条含错配碱基的DNA链互补形成的双链分子。在寡核苷酸指导的定点诱变中，诱变寡核苷酸引物与单链模板退火并延伸合成得到闭环异源双链DNA，其诱变位点存在碱基错配。该异源双链DNA转染宿主细胞后复制，可产生野生型和突变型两类双链DNA。

易错PCR｜error-prone PCR

易错PCR(error-prone PCR)是一种在PCR反应中通过调整反应条件(如使用低保真度DNA聚合酶、不平衡的dNTP浓度或添加Mn²⁺等)以降低保真度，从而在扩增产物中随机引入碱基错配的体外诱变技术。

引物链｜primer strand

引物链是指在DNA复制或PCR等过程中，与模板链互补配对并提供游离3’-OH末端的一小段寡核苷酸链，DNA聚合酶以此作为起点催化新生链的合成。在体内复制时，引物链通常为RNA，在PCR等体外扩增中则为人工合成的DNA片段。引物链的选择和设计对于特异性扩增目标序列至关重要。

荧光素酶｜luciferase

荧光素酶是一类催化生物发光反应的酶，通常作为报告基因用于检测外源基因的表达，其作用是通过催化底物氧化产生荧光信号。

营养缺陷型｜auxotroph

营养缺陷型（auxotroph）是指由于基因突变导致自身不能合成某种必需的生长因子（如氨基酸、维生素等），因而只能在含有该生长因子的培养基上生长的微生物菌株。在重组 DNA 技术中，营养缺陷型常作为选择性标记，通过载体携带的相应野生型基因进行互补，从而筛选出含有目的重组子的转化细胞。

诱发毛根质粒｜Ri plasmid

诱发毛根质粒（Ri plasmid）是存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）中的一种双链闭环DNA质粒，其大小约200 kb，能诱导植物产生发状根瘤。与Ti质粒相似，Ri质粒含有T-DNA区域和毒性（vir）区域，其中T-DNA可整合到植物基因组中，导致植物细胞转化并形成毛根。该质粒已作为植物基因工程的常用载体，用于外源基因的导入和表达。

愈伤组织培养｜callus culture

愈伤组织培养是将植物伤口产生的愈伤组织（一团软薄壁细胞）在离体条件下进行增殖和分化的培养技术。在含无机盐、糖、维生素、氨基酸和植物激素的培养基上，愈伤组织保持未分化状态并持续分裂；通过调整生长素与细胞分裂素等激素配比，可诱导其定向分化出根、芽等器官，最终再生完整植株。该技术基于植物细胞全能性，广泛用于转基因植株培育和单倍体育种。

原生质体培养｜protoplast culture

原生质体培养是一种植物组织培养技术，指用纤维素酶和果胶酶消化植物细胞壁获得原生质体，再在适当培养条件下诱导其脱分化、再分化，最终再生出完整植株。该技术基于植物细胞全能性，是获得转基因植株的重要途径之一。

增殖细胞核抗原｜proliferating cell nuclear antigen

增殖细胞核抗原(PCNA)是真核生物DNA复制中的辅助蛋白，作为DNA聚合酶δ的滑动夹，增加DNA复制的持续合成能力。

章鱼碱｜octopine

章鱼碱是一种冠瘿碱，由根瘤土壤杆菌诱导植物形成的冠瘿瘤大量合成并分泌，为细菌提供营养；其生物合成受 Ti 质粒基因调控，属于冠瘿碱代谢的产物。

脂质转染法｜lipofection

脂质转染法是一种将外源基因导入动物细胞的方法，它利用人工制备的脂质体包裹DNA，通过与细胞质膜融合而将DNA送入细胞。

直接鸟检测序法｜direct shotgun sequencing

直接鸟枪测序法（direct shotgun sequencing）是将基因组DNA通过机械法或酶切法随机打断成大量具有重叠序列的小片段，连接至载体后直接进行双脱氧链终止法测序，进而借助计算机依据片段间的重叠序列拼接获得完整基因组DNA序列的策略。为保证序列覆盖完整且拼接可靠，通常需进行多倍覆盖率的测序工作。

植物生长素｜auxin

植物生长素（auxin）是植物体内的一类重要激素，属于植物激素。在植物组织培养中，植物生长素与细胞分裂素的相对浓度决定细胞分化方向，当植物生长素对细胞分裂素的比值达到较高水平时，可诱导根的产生。

植株再生｜plant regeneration

植株再生是指植物体通过无性生殖方式，由外植体或细胞经脱分化和再分化形成完整植株的过程。其基础是植物细胞具有全能性，分化的植物细胞在适当条件下可重新获得发育成完整植株的潜能。通常通过愈伤组织培养或原生质体培养，并在植物激素（如生长素和细胞分裂素）的调控下诱导根和芽的分化。该技术常用于转基因植株的获得。

转基因沉默｜transgene silencing

转基因沉默指外源基因整合至宿主基因组后，其表达受到抑制或被关闭的现象。它是转基因植物中需克服的关键问题之一，常导致转基因失活。可通过在表达载体中外源基因两侧插入核基质附着区（MAR）序列等策略来提高表达稳定性。

转基因失活｜transgene inactivation

转基因失活是指外源基因导入受体植株后，其表达受到抑制或丧失稳定表达能力的现象，也称转基因沉默。在植物基因工程中，为提高外源基因的表达水平和特异性，需克服转基因失活，常通过构建高效表达载体和避免转基因沉默等策略实现。

转录后基因沉默｜post-transcriptional gene silencing

转录后基因沉默是指在基因转录完成后，通过特定机制降解mRNA或抑制其翻译，从而降低基因表达水平的现象。它不改变基因的转录速率，而是作用于已转录的RNA分子，导致基因功能部分丧失。

准随机切割｜quasi-random cleavage

准随机切割是一种在基因组测序中用于产生DNA片段的策略，通过限制酶部分消化等方法获得近似随机断裂的片段群，但由于切割位点受限于酶识别序列的分布，其断裂并非完全随机。该方式常用于鸟枪法测序，产生大量具有重叠序列的小片段，以便后续拼接完整的基因组序列。

转录水平基因沉默｜transcriptional gene silencing

转录水平基因沉默是指在基因转录起始阶段受到抑制，导致基因表达水平降低的现象。其常由启动子DNA甲基化、染色质结构改变或转录因子受到阻遏等因素引起，使RNA聚合酶无法有效结合或起始转录，从而关闭基因的转录活性。这种沉默机制属于表观遗传调控，在转基因沉默及细胞分化中发挥重要作用。

组成型表达｜constitutive expression

组成型表达是指持家基因持续不断的表达方式，其表达产物在细胞内大致以恒定水平始终存在。这类基因通常编码结构蛋白和维持基本生理功能的蛋白质，在细胞中不受时序或环境条件变化的显著影响而持续表达。

转染｜transfection

转染是指将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞的过程，以与通过病毒颗粒感染的途径相区别。该技术常用于原核细胞，例如用氯化钙法使大肠杆菌细胞处于感受态，再经热激促使病毒DNA进入细胞。

自身引发PCR｜self-primed PCR

自身引发PCR是指在PCR过程中，单链模板DNA的3’端因自身序列互补形成发夹结构，该区域作为引物引发DNA延伸，导致非特异性扩增的现象。