染色体与DNA

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染色体与DNA·

由GPT-5.6-Sol-Ultra生成

核酸与遗传物质·

  • DNA控制多数生物的性状遗传；部分病毒和类病毒以RNA为遗传物质。

  • DNA和RNA均为由多个核苷酸连接而成的链状生物大分子。

  • 核苷酸（nucleotide）

    磷酸、核糖和碱基组成的核酸基本结构单位。

  • 核苷（nucleoside）

    核糖与碱基组成的化合物；核苷酸可分解为核苷和磷酸。

  • 单核苷酸通过 $3’,5’$-磷酸二酯键连接成链。

核酸 核糖 碱基
DNA D-2’-脱氧核糖 A、G、T、C
RNA D-核糖 A、G、U、C，U取代T

核苷酸组成及DNA、RNA碱基结构

染色体·

染色体概述·

  • 染色体（chromosome）

    由DNA和蛋白质构成，是遗传物质的主要载体。

  • DNA包装成染色体后才能保持稳定，并把编码的遗传信息稳定传给子代。

  • 同一物种中每条染色体所带DNA量相对固定；不同染色体或物种间可相差很大。

    • 人X染色体约含 $1.28\times10^8\ \mathrm{bp}$。
    • 人Y染色体约含 $0.19\times10^8\ \mathrm{bp}$。

  • 染色体中组蛋白和非组蛋白的种类、含量也相对稳定。

  • 作为遗传物质，染色体应具有4个特征

    1. 分子结构相对稳定。
    2. 能自我复制，使亲、子代保持连续性。
    3. 能指导蛋白质合成，控制生命过程。
    4. 能产生可遗传变异。

染色体与染色质·

  • 分裂期：染色质高度凝集，形成光学显微镜下可见的棒状可染色结构，即染色体。

  • 分裂间期：染色体以较细、松散的染色质形式存在于细胞核中。

  • 非分裂期染色质在电镜下呈纤维串珠状长丝，包含DNA双螺旋和蛋白质。

  • 原核与真核染色体比较

项目 原核生物 真核生物
位置 无真正细胞核，DNA位于类核体 有明确核结构
数目与倍性 通常一条染色体、单倍；快速生长的大肠杆菌可有数条 体细胞通常二倍体，配子为单倍体
DNA形态 共价闭合双链分子，相对分子质量约 $10^9$ 多条线性DNA染色体
DNA与蛋白质 外裹稀疏蛋白，参与折叠、复制、重组和转录 DNA与蛋白质紧密结合，蛋白质:DNA质量约为 $2:1$
主要组成 DNA及少量结合蛋白 DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA
基因组织 多为单拷贝，功能基因和调控序列占绝大部分 重复和非编码序列多，染色体结构参与表达调控
转录产物 常见多顺反子mRNA 单顺反子
基因结构 基因序列与所编码蛋白质序列近似线性对应 断裂基因，含内含子
  • 二倍体中每个基因有两个拷贝；配子各携带一个，精卵结合形成合子后恢复二倍体，使每个基因分别获得父、母本各一个拷贝。
  • 真核染色体中的RNA不到DNA含量的10%，主要是尚未完成转录、仍与模板DNA相连的RNA。
  • 真核DNA分子大，并被大量蛋白质和核膜包围；转录与翻译在不同时间和空间进行，因此表达调控既与DNA序列有关，也与染色体结构有关。

真核细胞染色体的组成·

组蛋白·

  • 组蛋白是染色体结构蛋白，与DNA共同组成核小体。
  • 可用 $2\ \mathrm{mol/L}$ NaCl或 $0.25\ \mathrm{mol/L}$ HCl/$\mathrm{H_2SO_4}$ 使组蛋白与DNA分离，再用离子交换层析分离。
  • 按凝胶电泳性质分为 $H_1$、$H_{2}A$、$H_{2}B$、$H_3$、$H_4$。
    • $H_1$ 富含Lys。
    • $H_3$、$H_4$ 富含Arg。
    • $H_{2}A$、$H_{2}B$ 介于两者之间。
组蛋白 相对分子质量 氨基酸数 保守性 染色质中比例 染色质位置
$H_1$ 21 000 223 不保守 0.5 接头
$H_{2}A$ 14 500 129 较保守 1 核心
$H_{2}B$ 13 800 125 较保守 1 核心
$H_3$ 15 300 135 最保守 1 核心
$H_4$ 11 300 102 最保守 1 核心

  • 组蛋白的主要特性

    1. 进化上高度保守
      • $H_3$、$H_4$ 最保守，$H_{2}A$、$H_{2}B$ 次之，$H_1$ 变化最大。
      • 教材据此推测 $H_3$、$H_4$ 对稳定真核染色体结构很重要。
    2. 一般无组织特异性
      • 教材列出的例外：鸟类、鱼类和两栖类红细胞染色体不含 $H_1$ 而含 $H_5$；精细胞染色体的组蛋白为鱼精蛋白。
    3. 氨基酸分布不对称
      • 碱性氨基酸集中于N端半链，疏水基团多在C端。
      • $H_4$ 的N端半链净电荷为 $+16$，C端仅为 $+3$。
      • 碱性半链易结合带负电的DNA，另一半链可结合其他组蛋白或非组蛋白。
    4. 可发生多种翻译后修饰
      • 包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、丙酰化、丁酰化、琥珀酰化和巴豆酰化等。
      • 修饰共同构成“组蛋白密码”，具有细胞周期时间特异性和位点特异性。

  • 组蛋白修饰的总效应

    • 改变组蛋白与DNA的亲和力，使染色质疏松或凝集。
    • 改变转录因子与结构基因启动子的亲和力。
    • 最终影响染色质结构和基因表达。

甲基化·
  • 由组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶催化，是可逆修饰。
  • Lys可发生单、双、三甲基化；Arg可发生单、双甲基化。
  • 常见位点
    • $H_3$：K4、K9、K27、K36及R2、R17、R26。
    • $H_4$：K20及R3。
  • 功能联系
    • H3K4甲基化：主要聚集于活跃转录的启动子。
    • H3K9、H3K27甲基化：与转录抑制或异染色质化有关。
    • H3K36、H3K79甲基化：参与转录激活。
  • 甲基化较稳定，适合作为表观遗传信息；异常可与肿瘤等疾病有关。

乙酰化·
  • 主要发生在核心组蛋白N端保守Lys上；$H_3$、$H_4$ 的乙酰化程度高于 $H_{2}A$、$H_{2}B$。
  • 含活性基因的DNA结构域中，组蛋白乙酰化程度较高。
  • 组蛋白乙酰基转移酶和去乙酰化酶共同维持动态平衡。

乙酰化 → DNA与组蛋白八聚体较易解离 → 核小体松弛 → 转录因子和协同因子易结合 → 转录激活；去乙酰化作用相反。

  • 乙酰化和去乙酰化还参与DNA修复、拼接、复制、染色体组装及信号转导。

组蛋白N端残基的常见化学修饰


其他修饰与特殊组蛋白·
  • 泛素化
    • $H_1$、$H_{2}A$、$H_{2}B$、$H_3$ 均可在保守Lys上发生。
    • 不导致组蛋白降解，而参与染色体形成、X染色体失活、组蛋白甲基化、转录及DNA损伤应答。
  • ADP-核糖基化
    • $H_1$、$H_{2}A$、$H_{2}B$、$H_3$ 可与多聚ADP-核糖共价结合。
    • 教材称其为真核细胞启动复制过程的“开关”。
  • $H_5$
    • 成熟鱼类和鸟类红细胞中，$H_5$ 取代 $H_1$。
    • 教材认为 $H_5$ 的积累可能与红细胞染色质失活有关，其磷酸化可能在失活中起重要作用。

非组蛋白·

  • 染色体中组蛋白总量约与DNA等量；非组蛋白约为组蛋白总量的60%～70%，种类约20～100种。

  • 非组蛋白包括RNA聚合酶、收缩蛋白、骨架蛋白、核孔复合物蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白和原肌蛋白等。

  • HMG蛋白（high mobility group protein）

    • 相对分子质量小于 $3.0\times10^4$，电泳迁移快。
    • 富含Lys、Arg、Glu和Asp，是除组蛋白外含量最丰富的染色质蛋白。
    • 能结合DNA和 $H_1$，但结合较弱；可能参与DNA超螺旋、染色质结构和基因表达调控。

  • DNA结合蛋白

    • 去除全部组蛋白和70%非组蛋白后仍紧密结合DNA。
    • 约占非组蛋白20%、染色质8%，可能是复制或转录相关的酶和调节物质。

  • A24非组蛋白

    • C端与 $H_{2}A$ 相同，并有两个N端：一个与 $H_{2}A$ 相同，另一个与泛素相同，是附加在 $H_{2}A$ Lys119的 $\varepsilon\text{-}\mathrm{NH_2}$ 上的多肽。
    • 含量约为 $H_{2}A$ 的1%，位于核小体内；可能具有rDNA抑制作用，但具体功能尚未确定。

真核生物基因组DNA·

  • 基因组大小（genome size）

    一种生物单倍染色体组中DNA的总长度。

  • 基因密度（gene density）

    每Mb基因组DNA所含的平均基因数。

  • 真核基因组富含重复序列，编码序列常被非编码序列隔开。

  • 基因组大小总体上随进化和复杂性增加，但并非绝对正相关

    • 蝗虫基因组约为果蝇的25倍。
    • 水稻基因组约为小麦的 $1/40$。

  • 基因数与复杂性的联系可能比基因组大小更密切。

  • 一般基因密度越高，生物复杂性越低；真核生物复杂性增加时，基因长度和基因间隔区增加，使基因密度下降。

  • 人基因组中功能未知的基因间隔序列超过60%，可分为唯一性和重复性序列；唯一性序列约占基因间隔区的 $1/4$，整个基因组一半以上由多次重复的DNA序列组成。

真核DNA序列的3类组成·

  1. 不重复序列
    • 单倍体中通常只有一个或少数几个拷贝，占总DNA的40%～80%。
    • 长约750～2 000 bp，约相当于一个结构基因；结构基因基本属于此类。
  2. 中度重复序列
    • 重复 $101\sim104$ 次，占总DNA的10%～40%。
    • 包括rRNA、tRNA和部分结构基因，如组蛋白基因，常分散在不重复序列间。
    • 非洲爪蟾卵细胞形成时，rDNA可扩增至 $2\times10^6$ 个拷贝，使其积累约 $10^{12}$ 个核糖体，以满足大量蛋白质合成需要。
  3. 高度重复序列/卫星DNA
    • 教材称仅见于真核生物，占基因组的10%～60%。
    • 重复单位长6～100个碱基，在DNA链上串联成千上万次。
    • CsCl密度梯度离心时在DNA主峰外形成小峰，因而称为卫星DNA。
    • 多位于着丝粒，少数位于染色体臂；高度浓缩，是异染色质的组成部分。
    • 不转录，功能尚不明确，可能与染色体稳定性有关。

真核基因组的主要特点·

  1. 基因组庞大，通常远大于原核基因组。
  2. 含大量重复序列。
  3. 非编码序列超过90%，是与细菌、病毒基因组的重要区别。
  4. 转录产物为单顺反子。
  5. 真核基因是断裂基因，具有内含子结构。
  6. 含大量顺式作用元件，如启动子、增强子和沉默子。
  7. DNA多态性丰富，主要包括SNP和串联重复序列多态性。
  8. 具有端粒结构。
    • 端粒（telomere）：真核线性基因组DNA末端的DNA-蛋白质复合体。
    • 端粒DNA序列较保守，通常由短寡核苷酸串联重复构成。
    • 人端粒DNA长约5～15 kb。
    • 保护线性DNA完整复制和染色体末端，并参与决定细胞寿命。

染色质与核小体·

核小体模型的实验证据·

  1. 染色质DNA的 $T_m$ 高于游离DNA，提示DNA与蛋白质相互作用。
  2. 染色质状态下DNA复制和转录活性明显低于游离DNA。
  3. DNase I消化染色质DNA的速度远低于消化纯DNA。
  4. 电镜可见细丝连接的直径约10 nm球状颗粒；X射线衍射也显示10 nm重复单位。
  5. 小球菌核酸酶消化后出现200、400、600 bp等梯状片段，表明核小体重复单位约含200 bp DNA。

核小体结构与组装·

  • 核小体（nucleosome）

    由核心组蛋白八聚体、约200 bp DNA及外侧的一个 $H_1$ 组成的染色质基本结构单位。

  • 核心八聚体含 $H_{2}A$、$H_{2}B$、$H_3$、$H_4$ 各2个分子。

  • 组装顺序

    1. $H_3-H_4$ 四聚体形成。
    2. 四聚体与DNA结合。
    3. 加入两个 $H_{2}A-H_{2}B$ 二聚体，完成八聚体组装。

  • 核酸酶进一步消化后形成核心颗粒

    • 组蛋白八聚体结合146 bp核心DNA。
    • DNA绕核心1.65圈，教材称每圈约80 bp。

  • 核小体之间的连接DNA长约20～60 bp。

  • 核心组蛋白N端均有富含修饰位点的“尾巴”。

核小体单位及核心颗粒形成

  • 核小体重塑
    • 组蛋白与DNA的结合是动态的。
    • 重塑复合体利用ATP水解能量，使八聚体沿DNA滑动或在DNA分子间转移。
    • 结果是提高DNA的可接近性；组蛋白N端修饰也参与此调控。

DNA包装为染色体·

包装阶段 形成结构 宽度增加 长度压缩
DNA + 组蛋白 核小体/10 nm纤维 5倍 7倍
核小体 30 nm螺线管 3倍 6倍
螺线管 超螺旋 13倍 40倍
超螺旋 染色体单体 2.5～5倍 5倍
总计 染色体 500～1 000倍 约8 400倍
  • 10 nm纤维：低离子强度、缺少 $H_1$ 时，以核小体串联的念珠状细丝为主。
  • 30 nm螺线管：较高离子强度且有 $H_1$ 时形成，每圈约含6个核小体，是分裂间期染色质和分裂中期染色体的基本组分。
  • 10 nm与30 nm纤维可随离子强度变化而可逆转化。
  • $H_1$ 与核小体上的DNA结合，促进染色质进一步压缩。
  • 30 nm螺线管进一步盘绕为超螺旋，再压缩为染色体单体；总长度压缩 $7\times6\times40\times5=8\ 400$ 倍，约为 $10^4$ 倍。
  • 人中期染色体共含约 $6.2\times10^9\ \mathrm{bp}$ DNA，理论伸展长约200 cm，被包装进46条约 $5\ \mu\mathrm{m}$ 长的染色体中；分裂间期压缩比约为 $102\sim103$。

DNA多级包装形成染色体


原核生物基因组·

  • 基因组小，多数只有一条染色体，DNA含量少。
  • 大肠杆菌基因组
    • 相对分子质量约 $2.4\times10^9$。
    • 长约 $4.6\times10^6\ \mathrm{bp}$，完全伸展约1.3 mm。
    • 含4 000多个基因。
  • 细菌质粒、真核线粒体和高等植物叶绿体中的DNA及功能基因属于染色体外遗传因子。

结构简炼·

  • 绝大部分DNA用于编码蛋白质，只有很少一部分不转录。
  • 不转录区通常承担表达调控功能，如RNA聚合酶结合位点、转录终止信号和核糖体结合位点。

存在转录单元·

  • 功能相关的RNA和蛋白质基因常成簇排列，形成转录单元。
  • 一个转录单元可共同转录为多顺反子mRNA，实现相关基因协同表达。
  • 大肠杆菌操纵子也是转录功能单位；组氨酸操纵子产生一条多顺反子mRNA，再翻译为合成组氨酸所需的9种酶。

存在重叠基因·

  • 重叠基因

    同一段DNA携带两种不同蛋白质信息的基因组织方式。

  • $\Phi X174$ 的9种蛋白质总相对分子质量约 $2.5\times10^5$，相当于6 078 nt；其DNA仅5 375 nt，理论上最多编码总相对分子质量约 $2.0\times10^5$ 的多肽，重叠基因解释了这一容量矛盾。

  • 3种主要形式

    1. 一个基因完全位于另一个基因内部，如B位于A内、E位于D内。
    2. 两个基因部分重叠，如K与C。
    3. 仅重叠1 bp，如D终止密码子最后一个碱基同时为J起始密码子的第一个碱基。

  • 重叠区一个碱基改变可能影响后续肽链序列，使其编码完全不同的蛋白质。

  • SV40和G4噬菌体中也存在重叠基因；教材认为其可能是自然选择的结果。

DNA的结构·

DNA的一级结构·

  • DNA又称脱氧核糖核酸，基本单位为脱氧核苷酸。
  • 磷酸和脱氧核糖在各种DNA中相同，含氮碱基为A、G、C、T。
碱基 核苷 核苷酸 DNA形式
腺嘌呤A 腺苷 腺苷酸 dAMP
鸟嘌呤G 鸟苷 鸟苷酸 dGMP
胞嘧啶C 胞苷 胞苷酸 dCMP
胸腺嘧啶T 胸苷 胸苷酸 dTMP

  • 多个脱氧核苷酸经磷酸二酯键聚合成DNA链。

  • DNA可为线性或环状；绝大多数由两条互补链组成，少数噬菌体或病毒DNA为单链。

  • DNA一级结构

    4种核苷酸的连接和排列顺序，表示DNA分子的化学构成。

  • A-T、C-G配对种类有限，但碱基排列顺序可高度变化

    • 不同排列产生DNA分子的多样性。
    • 特定排列构成DNA分子的特异性。
    • 不同DNA序列可编码完全不同的多肽。

  • 一级结构决定高级结构，高级结构又决定或影响一级结构的功能。

    • B-DNA中的多G-C区易形成Z-DNA。
    • 反向重复DNA片段易形成发夹结构。

DNA的二级结构·

  • DNA二级结构

    两条多核苷酸链反向平行盘绕形成的双螺旋结构。

  • 糖和磷酸交替连接，在外侧构成骨架；碱基位于内侧。

  • 两链通过碱基间氢键结合，遵循碱基互补配对原则

    • A与T配对。
    • G与C配对。

  • 活体内DNA构象不断变化，在各二级结构之间、二级结构与高级结构之间维持动力学平衡。

  • 双螺旋构象

    • 右手螺旋：A-DNA、B-DNA，DNA通常以右手螺旋存在。
    • 左手螺旋：Z-DNA。

A-DNA、B-DNA、Z-DNA及左右手螺旋比较


B-DNA·

  • Watson和Crick于1953年提出双螺旋模型的3项依据
    1. X射线衍射显示DNA是规则螺旋。
    2. 密度测量表明螺旋由两条多核苷酸链组成。
    3. 碱基含量始终满足 G=C、A=T。
  • 模型描述较高湿度下DNA钠盐的B型结构。
  • B-DNA含水量较高，是大多数DNA在细胞内的构象，规则而稳定。
  • 两条链围绕同一轴形成右手螺旋
    • 一条链方向为 $5’\rightarrow3’$。
    • 另一条链方向为 $3’\rightarrow5’$。
  • 糖-磷酸骨架在外，碱基对层叠于内；碱基平面与纵轴垂直。
  • 主要参数
    • 相邻碱基对平面间距：$0.34\ \mathrm{nm}$。
    • 每轮约10个碱基对，结构周期：$3.4\ \mathrm{nm}$。
    • 正文所列双螺旋直径：$2.0\ \mathrm{nm}$。
    • 具有大沟和小沟。
  • A-T丰富的DNA片段常呈B-DNA；B’-DNA、C-DNA、D-DNA等也接近B型。

A-DNA·

  • 相对湿度低于75%时形成，仍为右手双螺旋。
  • 螺旋宽而短，每轮约11个碱基对。
  • 碱基对倾角较大并偏向螺旋边缘；大沟深而窄，小沟宽而浅。
  • DNA-RNA杂交双链呈A-DNA构象；转录时模板DNA与新生RNA形成的双链属于此类，教材据此认为A-DNA构象对基因表达有重要意义。
  • 两条RNA链形成的双螺旋也呈A-DNA构象。

Z-DNA·

  • 1979年，Rich根据d(CGCGCG)晶体的X射线衍射分析提出Z-DNA模型。

  • 左手螺旋，整体细长；每轮约12个碱基对。

  • 骨架呈Z字形，核苷酸顺、反式构象相间。

  • 大沟平坦，小沟深而窄。

  • Z-DNA是右手螺旋模型的补充和发展，并不否定右手螺旋学说。

  • 对转录的两种调控模式

    • 邻近调控：Z-DNA抑制相邻转录区；转为B-DNA后，转录得以激活。
    • 远距离调控：转录区可位于上千个碱基对以外；Z-DNA改变负超螺旋水平，影响聚合酶与模板结合，从而调节转录起始活性。

A、B、Z-DNA比较·

参数 A-DNA B-DNA Z-DNA
螺旋方向 右 右 左
碱基倾角 $20^\circ$ $6^\circ$ $7^\circ$
碱基间距 0.26 nm 0.34 nm 0.37 nm
螺旋直径 2.55 nm 2.37 nm 1.84 nm
每轮碱基数 11 10 12
大沟 很狭、很深 宽、较深 平坦
小沟 很宽、浅 狭、较深 很狭、很深
糖苷键构象 反式 反式 C反式、G顺式
  • 教材正文与表2-7口径不完全一致
    • B-DNA直径：正文为2.0 nm，表中为2.37 nm。
    • B-DNA小沟：正文称较浅，表中称狭、较深。

DNA双链的变性与复性·

  • DNA变性（denaturation）

    温度接近沸点或pH较高时，互补双链分开，由有序双螺旋转变为无规则单链。

  • DNA复性

    变性DNA缓慢降温时，互补链重新聚合并恢复规则双螺旋。

  • 变性和复性可用于Southern印迹杂交和DNA芯片分析。

  • DNA在260 nm处吸光度最大。

  • 双链DNA的吸光度比单链DNA低40%。

    • 增色效应（hyperchromicity）：升温变性时 $A_{260}$ 明显升高。
    • 减色效应（hypochromicity）：双螺旋中的碱基堆积使紫外吸收降低。

  • 熔点（$T_m$）

    DNA吸光度增加到最大增幅一半时的温度，是DNA的重要特征常数。

  • 影响 $T_m$ 的因素

    1. G+C含量

      • G+C含量越高，$T_m$ 越高。
      • 教材归因于G-C间有3个氢键，且相邻碱基对间堆积力较大。

      $$ T_m=69.3+0.41(G+C)% $$

      • 可据此推算DNA的碱基百分组成。
      • 小于25 mer的寡核苷酸：

      $$ T_m=4(G+C)+2(A+T) $$

    2. 离子强度

      • 高离子强度：阳离子中和磷酸基负电荷，稳定双螺旋，$T_m$ 较高且熔解范围较窄。
      • 低离子强度：两链静电斥力增强，$T_m$ 较低且熔解范围较宽。
      • 因此DNA在含盐缓冲液中较稳定，在稀电解质中较难保存。

    3. DNA均一性

      • 均质DNA熔解温度范围较小。
      • 异质DNA熔解温度范围较宽；教材据此称 $T_m$ 可作为衡量DNA样品均一性的标准。

DNA变性曲线及影响因素（教材图2-17之一）

DNA变性曲线及影响因素（教材图2-17之二）


DNA的高级结构·

  • DNA高级结构

    双螺旋进一步扭曲、盘绕形成的复杂特定空间结构，包括超螺旋、线性双链纽结和多重螺旋等。

  • 超螺旋是DNA高级结构的主要形式

    • 正超螺旋：右手超螺旋，是过度缠绕的双螺旋。
    • 负超螺旋：左手超螺旋，是细胞内常见形式。

  • 正、负超螺旋可在不同类型拓扑异构酶作用下或特殊情况下相互转变；教材给出的关系为：

$$ \text{负超螺旋} \xrightarrow[\text{溴化乙锭}]{\text{拓扑异构酶}} \text{松弛DNA} \xrightarrow[\text{溴化乙锭}]{\text{拓扑异构酶}} \text{正超螺旋} $$

  • 超螺旋形成的条件
    • B-DNA通常每圈10个碱基对，处于能量最低状态。
    • 多转或少转使每圈碱基对数偏离10，会产生额外张力。
    • DNA末端自由时，可通过链旋转释放张力。
    • 末端固定或DNA为环状时，不能自由转动，张力造成分子扭曲并形成超螺旋。
  • 天然细菌质粒DNA以负超螺旋为主；稍被破坏即出现开环结构，两条链均断开则成为线性结构。
  • 相同相对分子质量DNA的电泳迁移率：

超螺旋DNA > 线性DNA > 开环DNA

  • 超螺旋圈数越多，电泳速度越快。

  • 拓扑关系

$$ L=T+W $$

  • $L$：连接数，环形DNA两链间交叉次数；只要链不断裂即为常量。
  • $T$：双螺旋盘绕数，为变量。
  • $W$：超螺旋数，为变量。
  • 双螺旋松开导致负超螺旋，拧紧导致正超螺旋。

超螺旋形成及不同DNA构象的电泳迁移

DNA的复制·

复制概述·

  • DNA自我复制以亲代DNA为模板，准确生成两个拷贝，并在细胞分裂时分配给两个子细胞。
  • DNA双链结构是遗传物质稳定和准确复制的基础。
  • 复制分为起始、延伸、终止3个阶段，普遍需要
    • 拓扑异构酶
    • 解旋酶
    • 单链DNA结合蛋白
    • 引物合成酶
    • DNA聚合酶
    • DNA连接酶

DNA的半保留复制·

  • 半保留复制（semiconservative replication）

    DNA双链解开后，两条亲链分别作为模板合成互补链；每个子代DNA均含一条亲链和一条新链。

  • 互补配对使每条亲链都含有合成另一条链所需的全部信息。

  • 半保留复制保证子代DNA与亲代DNA具有相同碱基顺序，并维持DNA在代谢和遗传上的稳定性。

Meselson-Stahl实验·

  1. 用 $^{15}\mathrm{N}$ 培养基长期培养大肠杆菌，获得重的 $^{15}\mathrm{N}$-DNA。
  2. 将细菌转入以 $^{14}\mathrm{N}$ 为氮源的普通培养基。
  3. 用CsCl密度梯度离心区分不同密度的DNA。
  4. 第1代DNA全部为中间密度，每个分子含一条 $^{15}\mathrm{N}$ 亲链和一条 $^{14}\mathrm{N}$ 新链。
  5. 第2代出现等量的 $^{14}\mathrm{N}$ 轻DNA和 ${14}\mathrm{N}$-${15}\mathrm{N}$ 杂合DNA。
  6. 继续培养，$^{14}\mathrm{N}$-DNA比例不断增加。

1958年Meselson和Stahl的实验首次证明DNA进行半保留复制。

DNA的半保留复制


DNA复制的基本概念·

  • 复制子（replicon）

    生物体内能独立复制的单位，即从固定复制起点到特定终点的DNA区域；每个复制子只有一个复制起点。

  • 复制叉（replication fork）

    DNA在复制起点解开形成的叉状结构，可沿DNA连续移动。

  • 复制起点（origin）

    • 细菌、酵母、线粒体和叶绿体的起点通常富含A-T，有利于双链解开。
    • 细菌、病毒和线粒体DNA通常为单复制子；真核基因组含多个复制子和多个起点。
    • 真核复制子并非同时工作，特定时间内通常不超过15%的复制子处于复制状态。

  • 复制终点（terminus）

    控制复制终止的位点；大肠杆菌环状DNA的终点位于起点相对方向约 $180^\circ$ 处。

  • 复制方向

    • 单向复制：一个起点产生一个复制叉，如质粒ColE1。
    • 双向复制：一个起点向两侧产生两个反向等速移动的复制叉，是原核、真核DNA最普遍的方式。
    • 相向复制：两个起点各启动一条新链，每个复制叉只有一条亲链作模板，见于某些线性DNA病毒。

  • 放射自显影判别

    • 先低放射性、后高放射性 $^3\mathrm{H}$-脱氧胸苷标记。
    • 单向复制呈一端低、一端高的银颗粒密度。
    • 双向复制呈中间低、两端高的银颗粒密度。

  • 复制速度

    • 真核复制时需先解开核小体、复制后再组装核小体，复制叉约为1 000～3 000 bp/min；通过多个起点和复制子同时复制来完成大基因组复制。
    • 细菌复制叉可达50 000 bp/min，每个复制单位约30～60 min完成，起点可连续发动。

冈崎片段与半不连续复制·

  • 产生原因

    1. DNA两条亲链反向平行。
    2. 所有已知DNA聚合酶都只能按 $5’\rightarrow3’$ 方向合成。
    3. 两条子链又需在复制叉处近乎同时合成。

  • 冈崎片段

    后随链复制过程中先形成、随后由连接酶连接成完整DNA链的短DNA中间体。

  • 实验证据

    • 冈崎用 $^3\mathrm{H}$-脱氧胸苷短时标记大肠杆菌，获得长1 000～2 000 nt的短DNA；延长标记时间后，短片段进入成熟DNA链。
    • DNA连接酶温度敏感突变株在连接酶失活时积累大量小DNA片段。

  • 原核冈崎片段较长，通常1 000～2 000 nt；真核通常100～400 nt。

  • 前导链（leading strand）

    • 按 $5’\rightarrow3’$ 合成。
    • 与复制叉移动同向，随双链解开而连续合成。

  • 后随链（lagging strand）

    • 每段均按 $5’\rightarrow3’$ 合成。
    • 合成方向与复制叉移动相反，先形成冈崎片段，再连接为完整链。

一条链连续复制、另一条链不连续复制，称为DNA的半不连续复制。

复制叉、前导链和后随链合成


DNA聚合酶的作用机制·

  • DNA聚合酶用同一活性位点催化4种dNTP的添加。
  • 只有形成正确A-T或G-C配对时，引物 $3’-\mathrm{OH}$ 与dNTP的 $\alpha$-磷酸才处于最佳催化位置。
  • 正确核苷酸的掺入速率约为错误核苷酸的 $10^4$ 倍，体现催化选择性。

3个结构域·

  • DNA聚合酶整体类似半握的右手，含手掌、手指和拇指3个结构域。
  • 手掌域
    • 含催化核心并结合两个 $\mathrm{Mg^{2+}}$ 或 $\mathrm{Zn^{2+}}$。
    • 检查最新加入核苷酸的配对；错配会降低催化活性，并使引物-模板转移到校对核酸酶位点。
  • 手指域
    • 结合进入的dNTP；正确配对时包围dNTP，使其靠近金属离子并促进催化。
    • 使模板弯曲，只暴露引物后的第一个模板碱基。
  • 拇指域
    • 与新生DNA相互作用，维持引物和活性位点的位置。
    • 加强聚合酶与底物结合，有利于连续添加dNTP。

延伸能力与校对·

  • 延伸能力（processivity）

    聚合酶每次与模板-引物结合后能够添加的平均核苷酸数。

  • 高延伸性聚合酶的合成速率可达完全非延伸性聚合酶的1 000倍。

  • 校对外切核酸酶从引物链 $3’$ 端移去最近加入的错配核苷酸。

    • 校对后，错误率约降至每 $10^7$ 个核苷酸一次。
    • 再经复制后错配修复，可降至每 $10^{10}$ 个核苷酸一次。

  • 滑动DNA夹（sliding DNA clamp）

    • 由多个相同亚基围成闭合环，与聚合酶组成复合体并沿DNA滑动。
    • 保持聚合酶与DNA紧密接触，显著提高延伸能力。
    • 中央孔径约3.5 nm，可容纳直径约2.0 nm的DNA双螺旋及水分子。
    • 各类生物中的滑动夹结构保守，均呈六边形对称，但亚基数可不同。

  • 滑动夹装载器由5个亚基组成，结合并水解ATP以打开滑动夹，将其装到引物-模板接头；相关酶完成工作后再移除滑动夹。


原核生物DNA复制·

大肠杆菌复制起点·

  • 大肠杆菌基因组为双链环状DNA，复制起始区位于遗传图84 min附近。
  • oriC 含
    • 3个13 bp串联保守序列：GATCTNTTNTTTT。
    • 4个9 bp的DnaA结合位点：TTATNCANA。
  • oriC产生两个反向等速移动的复制叉，中间体呈 $\theta$ 形，最终在距起点 $180^\circ$ 处会合。

解旋与单链维持·

  • DNA解旋酶：水解ATP获得能量并解开双链。
    • 多数教材所列解旋酶沿后随链模板 $5’\rightarrow3’$ 移动。
    • Rep蛋白沿前导链模板 $3’\rightarrow5’$ 移动。
  • SSB
    • 以四聚体存在于复制叉，只维持单链状态，不负责解链。
    • 原核SSB与单链DNA结合具有协同性；真核牛、鼠、人细胞的SSB无此协同效应。
  • DNA拓扑异构酶
    • 解旋使未解链区域正超螺旋积累，阻碍复制叉继续前进。
    • 拓扑异构酶解除这种扭转压力，使复制得以延伸。

复制的引发·

  • 所有已知DNA聚合酶都不能从头合成DNA，只能延长已有的、带游离 $3’-\mathrm{OH}$ 的引物。

  • **引发酶（primase）**是一种特殊RNA聚合酶，在DNA模板上合成短RNA引物。

    • 前导链通常只需一条RNA引物。
    • 后随链每个冈崎片段都需要一条新引物。

  • 后随链的引发体前体（preprimosome）由教材所列n、n’、n’'、DnaB、DnaC和DnaI等6种蛋白组成，再与dnaG产物引发酶装配为引发体（primosome）。

  • oriC有序起始过程

    1. ATP参与下，约20个DnaA结合4个9 bp位点，形成寡聚复合物。
    2. HU蛋白和ATP协助DnaA使3个13 bp重复序列变性，形成开链。
    3. DnaC帮助六聚体解旋酶DnaB替换DnaA并结合DNA。
    4. DnaB构象转变推动双链熔解；教材称每解开1 bp需水解1个ATP。
    5. SSB稳定单链，引发酶合成RNA引物，DNA聚合酶开始延伸。

大肠杆菌oriC处的复制起始


复制的延伸与终止·

  • 前导链：DNA聚合酶III在一条RNA引物后，与复制叉同向连续合成。

  • 后随链

    1. 引物酶合成约10 nt的RNA引物。
    2. DNA聚合酶III按 $5’\rightarrow3’$ 延伸，形成冈崎片段。
    3. DNA聚合酶I以 $5’\rightarrow3’$ 外切活性去除RNA引物并补齐缺口。
    4. DNA连接酶连接相邻冈崎片段。

  • 终止

    1. 复制叉遇到约22 bp重复终止子Ter。
    2. Ter-Tus复合物使DnaB停止解旋，阻挡该复制叉并等待反向复制叉到达。
    3. 两叉间仍有约50～100 bp未复制，由DNA修复机制补齐。
    4. DNA拓扑异构酶IV使复制叉解体并释放子代DNA。

大肠杆菌DNA聚合酶·

聚合酶 $3’\rightarrow5’$ 外切 $5’\rightarrow3’$ 外切 主要功能
Pol I + + 去除RNA引物、补缺口、校对与修复
Pol II + - DNA修复，聚合活性较低
Pol III + - 染色体新生链延伸的主导聚合酶
  • DNA Pol I
    • 首个被鉴定，但不是染色体主复制酶。
    • C端约占蛋白 $2/3$，称为Klenow片段，具有 $5’\rightarrow3’$ 聚合和 $3’\rightarrow5’$ 校对外切活性。
    • N端具有 $5’\rightarrow3’$ 外切活性，可去除冈崎片段RNA引物；教材也称其参与切除紫外线形成的嘧啶二聚体。
  • DNA Pol II
    • 聚合活性约为Pol I的5%，并有 $3’\rightarrow5’$ 校对外切活性。
    • 主要参与DNA修复，不是主复制酶。
  • DNA Pol III
    • 含7种亚单位、9个亚基，生物活性形式为二聚体。
    • 具有 $5’\rightarrow3’$ 聚合和 $3’\rightarrow5’$ 校对外切活性。
    • 活性约为Pol I的15倍、Pol II的300倍，可按约50 000 nt/min延长新链。
  • Pol IV、Pol V分别由dinB、$umuD’_2C$ 编码，参与DNA修复和跨损伤合成。

原核复制调控·

  • 不同生长速度下，DNA链延伸速度近似恒定，主要变化的是复制叉数目
    • 快速生长细胞复制叉多。
    • 缓慢生长细胞复制叉少，并有复制间隙。
  • 复制叉数反映复制起始频率；直接调控因子包括蛋白质和RNA。
  • 教材将复制子类比为操纵子：复制子由起始物位点和复制起点组成；前者编码复制调节蛋白，后者与调节蛋白相互作用并启动复制。
  • dnaA、dnaC和dnaT条件致死突变表明，相应调节蛋白参与决定复制起始频率和复制方式。
  • 染色体复制与细胞分裂通常同步，但不直接耦联
    • 复制起始不依赖细胞分裂。
    • 复制终止可引发细胞分裂。
  • 复制调控主要发生在起始阶段；复制一旦开始，通常持续到完成。
  • oriC为首选起点；oriH是在RNase H缺失突变株中发现的一系列起点，两者起始机制和调控方式不同。

真核生物DNA复制·

每个细胞周期精确复制一次·

  • DNA复制只发生在S期；第一批复制子激活标志S期开始，其余复制子随后依次启动。
  • 每个复制子在一次细胞周期内只能启动一次，重复复制会造成局部拷贝数增加。
  • 真核复制叉约50 bp/s，复制子长约40～100 kb；多起点保证每条染色体在S期完整复制。

pre-RC介导复制许可·

  • 酵母复制起点称为自主复制序列（ARS），长约150 bp，含复制必需保守区；共同A区具有11 bp A-T保守序列。
  • 真核复制起始分为两个时期
    1. $G_1$ 期进行复制器选择并形成前复制复合体pre-RC。
    2. 进入S期后，复制起点被激活。
  • pre-RC组装
    1. ORC结合复制器。
    2. 招募解旋酶装载蛋白Cdc6和Cdt1。
    3. 共同募集复制叉解旋酶Mcm2～7，形成pre-RC。
  • Cdk的双重作用保证每周期只复制一次
    • $G_1$ 期Cdk活性低，pre-RC能形成但不被激活。
    • S期Cdk和Ddk被激活，磷酸化pre-RC，促进复制蛋白组装和起始。
    • S、$G_2$、M期高Cdk活性又抑制新pre-RC形成。

Cdk调控pre-RC形成与激活


真核DNA聚合酶·

  • 真核生物已发现15种以上DNA聚合酶；哺乳动物主要有 $\alpha$、$\beta$、$\gamma$、$\delta$、$\varepsilon$ 5种。
  • 共性：以dNTP为底物，需要 $\mathrm{Mg^{2+}}$、模板及具有 $3’-\mathrm{OH}$ 的引物，延伸方向均为 $5’\rightarrow3’$。
聚合酶 亚基数 分布 主要功能 $3’\rightarrow5’$ 外切
$\alpha$ 4 细胞核 与引发酶形成复合体，合成引物并起始两条链 -
$\beta$ 1 细胞核 DNA损伤修复 -
$\gamma$ 2 线粒体 线粒体DNA复制 +
$\delta$ 2～3 细胞核 主要DNA复制酶，参与两条链合成 +
$\varepsilon$ $\geq1$ 细胞核 后随链合成、复制修复及重组 +
  • 以上5种聚合酶均无 $5’\rightarrow3’$ 外切活性。
  • 教材所述复制叉组合
    • 一个Pol $\alpha$/引发酶复合体。
    • 另有两个聚合酶复合体：一个为Pol $\delta$，另一个为第二个Pol $\delta$ 或Pol $\varepsilon$。
    • 前者延伸前导链，后者合成后随链冈崎片段。
  • 真核冈崎片段RNA引物的去除
    1. RNase H1在RNA-DNA接头附近内切引物。
    2. FEN1以 $5’\rightarrow3’$ 外切活性降解RNA片段。
    3. DNA连接酶I连接相邻冈崎片段。
  • Pol $\zeta$、$\eta$、$\iota$、$\kappa$ 等参与损伤修复，但忠实性较低。

末端复制问题与端粒酶·

  • 末端复制问题（end replication problem）

    • 线性DNA合成必须由引物启动。
    • 后随链最后一个RNA引物被移除后，染色体末端缺少足够空间再合成引物并补齐缺口。
    • 因此每轮复制可使一个子代DNA逐渐缩短，最终造成染色体末端基因丢失。

  • 两类解决方式

    1. 某些具有线性染色体的细菌和病毒以末端蛋白的氨基酸残基提供-OH，替代RNA引物的 $3’-\mathrm{OH}$。
    2. 多数真核细胞利用端粒酶延长染色体 $3’$ 端。

  • 端粒酶

    • 由蛋白质和RNA组成，具有反转录酶活性。
    • 自身RNA含1.5个完整端粒序列拷贝，可与端粒 $3’$ 单链退火并作为模板。
    • 以dNTP为原料添加端粒重复序列；人端粒重复单位为TTAGGG。
    • 端粒双链结合蛋白精确调节长度，防止无限延伸。

线性染色体的末端复制问题


真核复制的3级调控·

  1. 细胞周期/限制点水平
    • 决定细胞停留在 $G_1$ 期还是进入S期。
    • 促细胞分裂剂、致癌剂、外科切除及某些细胞质因子均可诱导DNA复制。
  2. 染色体水平
    • 决定不同染色体或同一染色体不同区域的复制子在S期按何种顺序起始；机制尚不清楚。
  3. 复制子水平
    • 决定复制是否起始，该调控从单细胞到高等生物高度保守。
    • 酵母复制子按专一时序启动，并受 $\alpha$ 因子和cdc基因调控。
    • ARS片段含14 bp核心，其中11 nt序列高度保守；点突变可使ARS失去起始功能。

DNA的突变与修复·

DNA突变·

  • 基因突变

    基因内遗传物质发生的、可以遗传的结构或数量变化。

  • 主要来源

    1. DNA复制错误。
    2. 遗传物质受到化学或物理损伤。
    3. 转座子插入引起DNA序列改变。

  • 自发突变频率很低，人工诱导可提高突变率。

  • 复制错误和DNA损伤的两类后果

    • 形成永久、不可逆的序列改变，即基因突变。
    • 某些化学变化使DNA不能继续作为复制和转录模板。

  • 主要突变类型

    • 碱基替换：一种碱基变为另一种碱基。
      • 转换（transition）：嘧啶与嘧啶之间或嘌呤与嘌呤之间替换。
      • 颠换（transversion）：嘧啶与嘌呤之间相互替换。
    • 点突变（point mutation）：单个核苷酸发生突变。
    • indel：一个或少数几个核苷酸插入或缺失。
    • 按编码后果还可分同义突变、错义突变、无义突变和移码突变等。

  • 突变积累可导致疾病，因此复制准确性和日常损伤修复非常重要。


DNA修复系统概览·

修复系统 主要处理对象 核心结果
错配修复 复制错误 识别并修正子链错配
碱基切除修复 受损碱基 切除异常碱基并补回DNA
核苷酸切除修复 嘧啶二聚体、大加合物等 切除含损伤的寡核苷酸片段
HR/NHEJ DNA双链断裂 通过同源模板或直接连接修复断裂
直接修复 嘧啶二聚体、甲基化DNA 直接恢复受损碱基状态
跨损伤合成 嘧啶二聚体、脱嘌呤位点等 绕过损伤以维持复制，但易错
SOS修复 严重DNA损伤或复制受抑 提高存活率，但显著降低保真度

错配修复·

  • **错配修复（mismatch repair）**识别新合成链中的错配，并遵循“保存母链、修正子链”的原则。

  • 母、子链识别依据

    • Dam甲基化酶使 $5’$-GATC序列中A的 $N^6$ 位甲基化。
    • 复制后短时间内，母链已甲基化而子链尚未甲基化，修复系统据此区分两链。

  • 基本过程

    1. MutS、MutL在ATP水解参与下结合错配位点。
    2. MutS-MutL沿DNA移动，找到甲基化位点。
    3. MutH切开未甲基化的子链。
    4. 根据错配与切口的相对方向，外切核酸酶去除含错配的单链片段。
      • 错配位于切口 $3’$ 下游端时，涉及MutL-MutS、DNA解链酶II、DNA外切酶VI或RecJ核酸酶。
      • 错配位于切口 $5’$ 上游端时，由DNA外切酶I或X参与切除。
    5. DNA聚合酶III和SSB协同合成新子链片段，恢复正确序列。

  • 错配修复几乎可完全纠正复制错配，对DNA复制忠实性贡献很大。

根据母链甲基化识别并切开错配子链


切除修复·

碱基切除修复·

  1. 特异性DNA糖苷水解酶识别受损碱基并切断 $N$-$\beta$ 糖苷键。
  2. DNA链形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称AP位点。
  3. AP内切核酸酶切开糖苷-磷酸键，并移去含AP位点的小片段DNA。
  4. DNA聚合酶I合成新片段，DNA连接酶完成连接。
  • 一类糖苷水解酶通常只识别一种特定损伤。
  • 例：尿嘧啶糖苷水解酶识别DNA中由C自发脱氨形成的U，但不水解RNA中的U。

核苷酸切除修复·

  • 当核苷酸损伤使双链不能正常形成氢键时，由核苷酸切除修复处理。
  • 基本过程
    1. DNA切割酶分别在损伤位点 $5’$ 和 $3’$ 两侧切开DNA。
    2. 移除含损伤的寡核苷酸片段。
    3. 原核由DNA聚合酶I、真核由DNA聚合酶 $\varepsilon$ 补回新片段。
    4. DNA连接酶封闭切口。
  • 切除片段长度
    • 原核生物：12～13 nt。
    • 人和其他高等真核生物：27～29 nt。
  • 教材进一步给出的切点
    • 原核：损伤核苷酸 $3’$ 端第5位和 $5’$ 端第8位。
    • 人细胞：损伤核苷酸 $3’$ 端第6位和 $5’$ 端第22位。

双链断裂修复·

同源重组修复·

  • **同源重组修复（HR）**利用细胞内同源DNA序列作为模板修复双链断裂。
  • 教材随后还以“复制后修复”描述重组修复的另一种损伤语境：复制越过未修复部位后留下子链缺口
    1. 复制机器先跳过尚未修复的损伤，在新生链留下缺口。
    2. 从未损伤的同源DNA找回对应序列信息，填补子链缺口。
    3. 再合成DNA补回供体母链的空缺。
  • 原核相关蛋白包括RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR；真核包括Rad51、Mre11-Rad50等。
  • 只有存在同源DNA片段时HR才能发生
    • 原核通常在DNA复制过程中发生。
    • 真核主要在S期和 $G_2$ 期发生。
  • HR依赖同源模板，是高保真修复方式。

非同源末端连接·

  • **非同源末端连接（NHEJ）**不需要同源模板。
  • 断裂末端突出的单链错排配对后，两个末端直接连接。
  • 由高度保守的KU蛋白家族介导。
  • NHEJ是易错修复方式。

同源重组修复与非同源末端连接


DNA直接修复·

  • 直接修复（direct repair）

    不切除碱基或核苷酸，直接把受损碱基恢复为原有状态。

  • DNA光解酶可把环丁烷胸腺嘧啶二聚体和6-4光化物还原为单体。

  • 甲基转移酶可使 $O^6$-甲基鸟嘌呤脱甲基化，防止形成G-T配对。


跨损伤合成·

  • 跨损伤合成（translesion synthesis，TLS）

    复制机器遇到未修复损伤而停顿时，由特殊DNA聚合酶越过损伤，防止复制叉崩塌的复制后修复方式。

  • 又称跨缺刻复制或备份复制。

  • 典型底物：嘧啶二聚体、脱嘌呤位点等。

  • SOS应答可诱导相关聚合酶表达

    • 大肠杆菌：Pol IV/DinB、Pol V/UmuD’$_2$C。
    • 真核Y家族：Pol $\eta$、$\iota$、$\kappa$、Rev1等。

  • 这些聚合酶依赖模板，但掺入核苷酸时不严格依赖碱基配对。

  • TLS高度易错：以增加突变为代价，避免染色体不完全复制并提高细胞存活率。

  • DNA损伤诱导PCNA泛素化，可促进Pol $\eta$ 聚集并启动TLS通路。

跨损伤合成


SOS修复系统·

  • SOS修复是DNA严重损伤或复制系统受抑时，为维持存活而启动的应急旁路系统。
  • 允许新生DNA链越过胸腺嘧啶二聚体继续复制，但保真度显著降低。
  • 反应包括
    • 诱导DNA损伤修复。
    • 诱变效应。
    • 抑制细胞分裂。
    • 使溶原性细菌释放噬菌体。
  • SOS修复存在于原核和真核生物中
    • 修复作用有利于细胞存活。
    • 产生变异可能带来细胞癌变等不利后果。

DNA的转座·

  • DNA转座/移位（transposition）

    由可移位因子介导的遗传物质重排现象。

  • 转座频率低于同源重组，但可解释细菌中的基因缺失、倒位，也常用于构建突变体。

  • 转座时原位常保留一个拷贝，新位点出现其复制产物，因此转座有别于同源重组，并依赖DNA复制。

  • 转座子（transposon，Tn）

    染色体DNA上能够自主复制和位移的基本单位。

  • 20世纪40年代，Barbara McClintock在玉米遗传研究中发现转座子。

  • 转座子存在于各种生物；教材称人基因组35%以上为转座子序列，其中大部分与疾病相关。

  • 两大类：插入序列和复合型转座子。

DNA转座的一般模式


插入序列·

  • **插入序列（insertional sequence，IS）**是最简单的转座子，不携带宿主基因。
  • 是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分，一个细菌细胞通常少于10个IS。
  • 可独立存在，携带介导自身移动的蛋白质，也可成为其他转座子的组成部分。
  • 结构特点
    • 长约1 kb。
    • 两端有反向重复序列。
    • 转座时复制靶位点4～15 bp，形成位于IS两侧的正向重复序列。
    • 除IS1外，已知IS通常只有一个开放读码框。
    • IS1含两个读码框，需移码通读才能形成有功能的转座酶。
  • 每个IS的转座频率约为 $10{-3}\sim10{-4}$/世代；恢复频率约为 $10{-6}\sim10{-10}$/世代。

复合型转座子与TnA·

  • 复合型转座子
    • 携带抗药性基因或其他宿主基因。
    • 两翼通常为两个相同或高度同源的IS。
    • 形成后两侧IS不再单独移动，只能作为复合体移动；转座能力主要由IS决定和调节。
  • TnA家族
    • 不含两端IS，长度大于5 000 bp。
    • 含3个基因：一个编码 $\beta$-内酰胺酶/AmpR，另两个为转座必需基因。
    • 两翼具有38 bp反向重复序列。

真核生物转座子·

  • 转座子存在于酵母、玉米、果蝇等低等和高等真核生物中，可在基因组内随机分布并重复移动。
  • 玉米控制因子分为
    • 自主性因子：能够自主剪接和转座。
    • 非自主性因子：单独存在时稳定、不能转座；同家族自主性因子提供反式作用的转座酶后才可移动。
  • 不同家族的自主性因子不能为非自主性因子提供转座功能。
  • 玉米转座子两端有反向重复序列，靶DNA插入位点形成短正向重复序列。

转座的遗传学效应·

  1. 引起插入突变
    • IS或Tn插入操纵子前半部分可造成极性突变，使后半部分结构基因失活。
  2. 产生新的基因或性状
    • 携带抗药性基因的转座子既造成插入突变，又使新位点获得抗药性。
  3. 产生染色体畸变
    • 复制型转座发生在宿主DNA原位附近时，转座子两个拷贝之间可发生同源重组。
    • 两个正向重复转座区间发生同源重组 → DNA缺失。
    • 两个反向重复转座区间发生同源重组 → DNA倒位。
  4. 促进生物进化
    • 把原来相距很远的基因组合成新的操纵子或表达单元，可能产生新功能基因和蛋白质。

SNP的理论与应用·

SNP概述·

  • 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）

    基因组DNA中由单个核苷酸A、T、C或G改变引起的多态性。

  • 染色体DNA同一位置上的每种碱基类型称为一个等位位点。

  • SNP是基因组中最简单、最常见且遗传稳定性很高的多态性形式，是继RFLP和SSR后的第三代遗传标记。

  • SNP可由颠换或转换产生

    • 转换约占总量的 $2/3$。
    • 主要原因是CpG中的C常被甲基化，可自发脱氨形成T。

  • 教材所列人类基因组数据

    • SNP发生频率约为1%或更高。
    • 每300～1 000 bp约有一个SNP。
    • 每个人携带约300万～1 000万个SNP。

  • 单倍型（haplotype）

    染色体某一区域内相互关联、倾向于作为整体传给后代的一组SNP等位位点。

染色体上共同遗传的SNP单倍型


SNP的分类·

  • 按基因组位置分为
    1. cSNP：基因编码区SNP。
    2. pSNP：基因调控区SNP。
    3. rSNP：基因间随机非编码区SNP。
  • 编码区变异率仅为周围序列的 $1/5$，因此cSNP总量显著少于另两类。
  • cSNP又分为
    • 同义cSNP：编码序列改变，但翻译所得蛋白质的氨基酸序列不变。
    • 非同义cSNP：导致蛋白质氨基酸序列及功能改变，可直接改变生物性状。
  • pSNP可影响基因表达量；非同义cSNP和pSNP在功能及疾病发生发展中更重要。

SNP检测与基因分型·

  • SNP检测方法
    • RFLP
    • PCR-SSCP
    • 毛细管电泳
    • 变性高效液相色谱/DHPLC
    • DNA测序法，是教材所称最常见的新SNP获取方法
  • 基因型分型（genotyping）

    利用数据库中已有SNP，研究特定人群中的序列及发生频率。

  • 主要方法：基因芯片、TaqMan、分子信标和焦磷酸测序。

SNP的应用·

  1. 绘制人类单倍型图
    • 少数标签SNP可代表某区域的大部分遗传多态性模式。
    • 目标是描述常见多态性模式及染色体上成组紧密关联的SNP区域。
    • 教材所述HapMap计划于2002年启动，已将超过150万个SNP定位到染色体，并对4个人种的269份DNA样品进行基因分型。
    • 单倍型图可为复杂疾病易感基因定位提供信息。
  2. 分析疾病易感基因
    • 若某遗传标记在患者中的频率明显高于非患者，提示该标记可能与疾病相关。
    • SNP研究可用于寻找高血压、哮喘、类风湿关节炎、肺癌和前列腺癌等疾病的易感基因。
  3. 指导用药与药物设计
    • SNP反映个体遗传差异，可用于分析个体对药物的敏感或耐受。
    • 有助于建立与基因型相关的治疗方案和个性化用药，并为按基因型设计药物提供依据。

本章名词·

DNA的半保留复制｜semiconservative replication　⭐真题

DNA的半保留复制是指DNA复制时，每个子代DNA分子含有一条来自亲代的旧链和一条新合成的互补链的复制方式。双链DNA解旋后，每条亲代链作为模板，按碱基互补配对原则合成新链，使子代DNA与亲代DNA碱基序列完全一致。这一机制确保了遗传信息在世代传递中的稳定性和准确性，并由Meselson和Stahl在1958年通过大肠杆菌的氮同位素标记实验得到证实。

DNA 的半保留复制｜semiconservative replication　⭐真题

DNA 在复制过程中, 每条链分别作为模板合成新链, 产生互补的两条链。这样新形成的两个 DNA 分子与原来 DNA 分子的碱基顺序完全一样。因此, 每个子代分子的一条链来自亲代 DNA, 另一条链则是新合成的, 这种复制方式被称为 DNA 的半保留复制。

基因密度｜Gene density

生物体内所有的染色体组成基因组, 每 Mb 基因组 DNA 上所含有的平均基因数目称为基因密度。

SNP｜Single Nucleotide Polymorphism

表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化。

错配修复｜mismatch repair

是对 DNA 错配区的修复。通过母链甲基化原则找出区分母链与子链从而修正子链上错配的碱基。

颠换｜tranversion

嘧啶到嘌呤和嘌呤到嘧啶的替换。

非组蛋白｜non-histone protein

是染色体中除了组蛋白之外的结构蛋白。

基因突变｜Mutation

是指在基因内的遗传物质发生可遗传的结构和数量的变化。

双向复制｜bidirectional replication

DNA 复制时, 以复制起始点为中心, 向两个方向进行的复制。

B-DNA的构象｜B-DNA

B-DNA的构象是指DNA钠盐在较高湿度下形成的B型右手双螺旋结构，是大多数DNA在细胞中的主要构象。该构象由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕而成，脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，碱基通过互补配对（A与T、G与C）以氢键结合排列在内侧。B-DNA结构规则稳定，含水量较高，是Watson和Crick于1953年提出的经典DNA双螺旋模型。

chaI｜ChaI

ChaI 是一种限制性内切酶，能够识别 DNA 分子中特定的核苷酸序列并切割磷酸二酯键，常用于重组 DNA 技术中对 DNA 进行定点切割。

DNA的半不连续复制｜semidiscontinuous replication

DNA半不连续复制是指DNA复制时，由于双链反向平行且所有DNA聚合酶仅能按5’→3’方向合成，导致前导链连续合成，后随链则先不连续合成许多长为1000～2000个碱基的冈崎片段，随后由DNA连接酶共价连接成完整子链的复制方式。这一模型由冈崎等通过放射性标记实验证实，后随链的合成方向与复制叉移动方向相反。

DNA的变性｜DNA denaturation

DNA变性是指在温度接近沸点或pH较高的条件下，DNA双螺旋的两条互补链因非共价键断裂而解离成单链的过程。该过程可逆，缓慢降温后单链可重新复性形成双螺旋。变性常伴随260nm处吸光度显著增加的增色效应，可用于监测变性过程。

DNA的二级结构｜DNA secondary structure

DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。其基本特点是：由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，脱氧核糖和磷酸交替连接排在外侧构成骨架，碱基排列在内侧；两条链上的碱基通过氢键互补配对，即A与T配对、G与C配对，形成碱基互补配对原则；常见构象包括右手螺旋的B-DNA等和左手螺旋的Z-DNA，不同构象间存在动态平衡。

DNA的熔点｜DNA melting temperature

DNA的熔点（melting temperature, Tm）是指DNA双链热变性过程中，紫外吸光度（260 nm）增加值达到最大值一半时所对应的温度。Tm值可反映DNA双链结构的稳定性，如染色质DNA的Tm值高于自由DNA。通过监测升温时DNA溶液的增色效应，可以获得其熔解曲线并确定Tm。

DNA的一级结构｜DNA primary structure

DNA的一级结构是指DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序，其基本单位是脱氧核苷酸。脱氧核苷酸由不变的磷酸和脱氧核糖以及可变的含氮碱基（A、G、C、T）组成，许多脱氧核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键聚合成DNA链。

DNA的转座｜DNA transposition

DNA转座是由可移位因子（转座子）介导的遗传物质重排现象。其特点是转座过程中一个拷贝常留在原位，新位点出现的是其拷贝，因此依赖于DNA复制，与同源重组不同。转座频率较低，但能引发插入突变、产生新基因、导致染色体畸变等遗传效应，对生物进化有重要意义。

DNA解链酶｜DNA helicase

DNA解链酶（DNA helicase）是一类通过水解ATP获得能量来解开双链DNA的酶。在DNA复制过程中，它与拓扑异构酶等共同作用，在复制起始点处解开双链，形成复制叉。大部分DNA解链酶沿后随链模板的5’→3’方向移动并随复制叉前进，少数（如Rep蛋白）沿前导链模板的3’→5’方向移动。

DNA聚合酶的延伸能力｜processivity of DNA polymerase

DNA聚合酶的延伸能力是指DNA聚合酶在一次结合模板期间所能连续催化的核苷酸聚合数量。该能力主要由滑动DNA夹赋予，滑动DNA夹是一种环状蛋白复合物，可套在DNA双螺旋上并与聚合酶形成复合体，使聚合酶在合成时沿模板高效滑动而不脱落，从而显著提高延伸能力。

DNA双螺旋模型｜DNA double helix model

DNA双螺旋模型是由Watson和Crick于1953年提出的DNA二级结构模型。该模型认为DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕成右手双螺旋，脱氧核糖和磷酸交替连接在外侧构成骨架，碱基排列在内侧，并通过氢键按A与T、G与C的互补配对原则形成碱基对。此模型解释了DNA的理化性质，并将DNA的结构与功能联系起来。

DNA损伤的修复｜DNA repair

DNA损伤的修复是指细胞针对各种内源或外源因素导致的DNA结构损伤，通过多种酶促修复系统恢复其正常结构与功能的过程。主要包括错配修复（纠正复制错误）、碱基切除修复（切除受损碱基）、核苷酸切除修复（切除含嘧啶二聚体或大加合物的核苷酸片段）、双链断裂修复（同源重组修复和非同源末端连接）、直接修复（如光复活修复嘧啶二聚体）、跨损伤合成（允许复制通过损伤但易错）和SOS修复（应急旁路修复，保真度低）等机制，以维护基因组完整性。

McClintock｜McClintock

美国遗传学家Barbara McClintock于20世纪40年代在玉米遗传学研究中首次发现转座子，揭示了Ac-Ds等可移动遗传因子系统，证明基因可在染色体上自主复制和位移，打破了孟德尔遗传学关于基因固定排列的传统观念，为转座子研究奠定基础，并因此获得诺贝尔生理学或医学奖。

Sharp｜Sharp

Sharp 并非教材片段涉及的标准术语，但在分子生物学中常指 SHARP (SMRT/HDAC1 Associated Repressor Protein)，该蛋白是一种转录抑制因子，通过招募组蛋白去乙酰化酶参与基因表达调控。

Stahl｜Stahl

Stahl是美国分子生物学家，与Meselson合作于1958年通过同位素标记大肠杆菌DNA的实验，首次证明了DNA的半保留复制。

Watson｜Watson

Watson，即James Watson，美国分子生物学家，与Francis Crick于1953年共同提出DNA双螺旋结构模型，并在此基础上推测了DNA半保留复制的机制，即DNA复制时双链解旋，每条链作为模板合成互补新链。

超螺旋结构｜supercoil

DNA超螺旋结构是DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的更复杂的空间结构，是DNA高级结构的主要形式。可分为正超螺旋（右手超螺旋）和负超螺旋（左手超螺旋），其中负超螺旋是细胞内常见的DNA高级结构形式，正超螺旋是过度缠绕的双螺旋。在不同类型拓扑异构酶作用下，正、负超螺旋和松弛DNA之间可以相互转变。

重叠延伸｜overlap extension

重叠延伸（overlap extension）是一种体外DNA重组技术，利用具有互补末端的引物进行PCR扩增，使不同DNA片段的末端彼此杂交延伸，从而将多个片段拼接成完整基因或引入定点突变，常用于基因构建与修饰。

复制起始点｜replication origin

复制起始点是DNA分子上启动复制的特定位点，是复制子的组成部分。其共同特点是富含AT碱基对，有利于复制启动时双链的解开。原核生物如大肠杆菌的oriC含有保守重复序列，真核生物如酵母的自主复制序列(ARS)包含A区保守序列，复制起始点可启动单向或双向复制。

滑动DNA夹｜sliding DNA clamp

滑动DNA夹（sliding DNA clamp）是DNA复制过程中与DNA聚合酶结合、显著提高其延伸能力的保守蛋白质复合物。它由多个相同亚基组装成“油炸圈饼”状结构，中央孔洞直径约3.5 nm，可容纳DNA双螺旋及参与合成的蛋白质和水分子。聚合酶与滑动夹形成复合体后，沿DNA模板高效滑动，保持与DNA的紧密接触，从而极大增强了聚合酶的持续合成能力。该蛋白在病毒、细菌、酵母和人类等多种生物中高度保守，均呈六边形对称结构，但组成夹子的亚基数在不同物种中可能不同。

碱基互补配对｜complementary base pairing

碱基互补配对是指在核酸分子（如DNA）的双链结构中，一条链上的碱基与另一条链上的碱基通过氢键按特定规律结合的一一对应关系，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）配对。它是DNA双螺旋结构稳定的重要基础，也是DNA复制和遗传信息准确传递的分子机制。此外，该原则也体现在tRNA的三叶草结构形成以及mRNA密码子与tRNA反密码子的相互识别过程中。

跨损伤合成｜translesion synthesis

跨损伤合成（translesion synthesis, TLS）是一类复制后修复，也称跨缺刻复制或备份复制。当DNA复制遇到嘧啶二聚体或脱嘌呤位点等未修复的损伤时，通过PCNA泛素化等信号招募跨损伤聚合酶（如pol η），使复制叉越过损伤部位继续合成，保障复制进程。该过程高度易错，是细胞在损伤胁迫下维持生存的应急机制。

末端复制问题｜end-replication problem

末端复制问题是指线性染色体DNA复制时，因后随链的合成需要RNA引物，而最后一个冈崎片段的引物去除后，引物酶缺乏足够空间合成新引物，导致子代DNA的3′端产生一段单链DNA，使DNA在每轮复制后逐渐缩短的现象。该问题源于所有DNA聚合酶均依赖引物起始合成，前导链的复制可完整进行，但后随链的末端无法完全复制。若不解决，将导致染色体末端基因丢失，破坏遗传信息的完整传递。

前复制复合体｜pre-replicative complex

前复制复合体（pre-RC）是真核生物DNA复制起始过程中在G₁期形成的一种蛋白质复合物，由起始点识别复合物（ORC）、解旋酶装载蛋白Cdc6和Cdt1以及Mcm2-7解旋酶复合体等组成。它介导复制起点的选择，为S期复制的起始做准备。pre-RC在G₁期组装后无活性，进入S期后在细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）等作用下被磷酸化激活，从而启动DNA复制，并确保每条染色体在每个细胞周期中仅复制一次。

上升突变｜up mutation

上升突变(up mutation)是指能增强基因表达或提高启动子活性的突变。在原核生物中，常由启动子-10区和-35区的序列或其间距变得更接近一致性序列所致，从而增加RNA聚合酶的结合亲和力或转录起始效率，导致基因转录水平上升。

同源重组修复｜homologous recombination repair

同源重组修复是利用细胞内同源染色体对应的DNA序列作为模板进行DNA修复的过程，主要修复DNA双链断裂，也被称为“复制后修复”，发生在复制之后。该修复通过从未损伤的同源DNA母链获取序列信息，填补新合成链上对应于损伤位置的缺口，从而恢复遗传信息的完整性。该过程受一系列蛋白质调控和催化，例如原核生物中的RecA、RecBCD、RecF等以及真核生物中的Rad51、Mre11-Rad50等。

下降突变｜down mutation

下降突变是指导致基因表达水平降低的突变，通常发生在启动子等调控区域，如改变-35区和-10区之间的间距可降低启动子活性，从而减弱转录效率，使基因产物减少。

限制点调控｜restriction point regulation

限制点调控是细胞周期水平上的DNA复制调控机制，决定细胞是否从G1期进入S期。该调控整合外部信号和细胞因子，如促细胞分裂剂等，以确保细胞在适宜条件下启动DNA复制，从而控制细胞增殖。

转录单位｜transcription unit

转录单位是一段从启动子开始到终止子结束的DNA序列，是RNA聚合酶识别并转录的连续模板，转录生成一条RNA链。在原核生物中，几个功能相关的结构基因及其调控序列可组成一个转录单位，转录产生多顺反子mRNA；真核生物中转录单位通常为单顺反子结构。转录单位包含启动子、转录区域和终止子等功能元件，是基因表达的基本功能单位。

左手螺旋——Z-DNA｜Z-DNA

Z-DNA是一种左手螺旋的DNA二级结构构象，由Rich于1979年通过d(CGCGCG)的X射线衍射分析提出。其螺旋细长，每圈含12对碱基，大沟平坦，小沟深而窄，核苷酸构象顺反相间，螺旋骨架呈Z字形。Z-DNA是B-DNA等右手螺旋构象的补充，可通过改变负超螺旋水平等方式参与基因转录调控。

AP 位点｜AP site

所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶, 它能特异性切除受损核苷酸上的 N- β 糖苷键, 在 DNA 链上形成去嘌呤或去嘧啶位点, 统称为 AP 位点。

DNA 的半不连续复制｜semi-discontinuous replication

DNA 复制过程中前导链的复制是连续的, 而另一条链, 即滞后链的复制是中断的、不连续的。

DNA 的变性｜denaturation) 和复性 (renaturation

变性是 DNA 双链的氢键断裂, 最后完全变成单链的过程。复性是热变性的 DNA 经缓慢冷却, 从单链恢复成双链的过程。

DNA 聚合酶｜DNA polymerase

一种催化由脱氧核糖核苷三磷酸合成 DNA 的酶。因为它以 DNA 为模板, 所以又被称为依赖于 DNA 的 DNA 聚合酶。不同种类的 DNA 聚合酶可能参与 DNA 的复制和 / 或修复。

DNA 聚合酶的延伸能力｜DNA polymerase processivity

是指每次聚合酶与模板 - 引物结合时所能添加的核苷酸的平均数, 它决定了 DNA 的合成速度。

DNA 拓扑异构酶｜DNA topoisomerase

能在闭环 DNA 分子中改变两条链的环绕次数的酶, 它的作用机制是首先切断 DNA, 让 DNA 绕过断裂点以后再封闭形成双螺旋或超螺旋 DNA。

P 转座子｜P-element

是一种能够诱发杂种不育(hybrid dysgenesis)的果蝇转座子, 果蝇中几乎所有的杂种不育都是由于 P 转座子插入基因组 W 位点而引起的。所有 P 转座子两翼都有 31 个碱基的倒置重复序列, P 转座子转座导致靶 DNA 复制产生 8 碱基正向重复序列。

错义突变｜missense mutation

由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。

重组修复｜Recombinant repair

又被称为“复制后修复”，它发生在复制之后。机体细胞对在复制起始时尚未修复的 DNA 损伤部位可以先复制再修复, 即先跳过该损伤部位, 在新合成链中留下一个对应于损伤序列的缺口, 该缺口由 DNA 重组来修复: 先从同源 DNA 母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处, 然后再用新合成的序列补上母链空缺。大肠杆菌的 rec 基因编码主要的重组修复系统。

复制起点｜replication origin

是 DNA 链上独特的具有起始 DNA 复制功能的碱基顺序。大肠杆菌的复制起点包括 OriC 和 OriH, OriC 是首选的复制起点, 而 OriH 是在 RNaseH 缺失突变株中发现的一系列复制起点。

后随链,滞后链｜lagging strand

在 DNA 复制过程中,与复制叉运动方向相反的方向不连续延伸的 DNA 链被称为后随链或滞后链。

结构变体｜Structural Variant, SV

染色体结构的变化, 包括片段插入、删除、倒转、易位、复制及拷贝数变化。

卫星 DNA｜satellite DNA

又称随体 DNA。真核细胞 DNA 的一部分是不被转录的异染色质成分, 其碱基组成与主体 DNA 不同, 因而可用密度梯度沉降平衡技术如氯化铯梯度离心将它与主体 DNA 分离。卫星 DNA 通常是高度串联重复的 DNA。

阳离子多聚体｜polycation

是一种表面具有带正电荷的氨基基团的多聚体, 氨基基团可与 DNA 的磷酸基团结合发生电性中和, 将 DNA 吸附而使其不易被核酸酶降解, 并可防止沉淀, 从而提高转染效率。

转录单元｜transcription unit

是一段可被 RNA 聚合酶转录成一条连续 mRNA 链的 DNA, 包括转录起始和终止信号。一个简单的转录单位只携带合成一种蛋白的信息, 复合转录单位可携带不止一种蛋白质分子的信息。

转座、移位｜transposition

遗传信息从一个基因座转移至另一个基因座的现象称为基因转座, 是由可移位因子(transposable element)介导的遗传物质重排。