DNA及RNA及蛋白质操作技术

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分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术·

由GPT-5.6-Sol-Ultra生成

研究方法概述·

  • 基因操作是分子生物学研究的核心技术，主要包括

    • DNA切割与连接
    • 核酸分子杂交与凝胶电泳
    • 细胞转化与核酸序列分析
    • 基因人工合成、定点突变及PCR扩增

  • 基因工程

    在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体，构成新的遗传物质组合，再导入新宿主，使其持续、稳定地增殖和表达。

  • 基因工程属于核酸操作，其根本特征是

    跨越天然物种屏障，使任意来源的外源基因能够在无亲缘关系的新宿主中繁衍并表达性状。

重组DNA技术·

理论与技术基础·

  • 现代分子生物学早期的3项主要成就

    1. 20世纪40年代确定DNA而非蛋白质是基因的分子载体，解决遗传的物质基础问题。
    2. 20世纪50年代提出DNA双螺旋结构和半保留复制机制，解释基因复制和世代传递。
    3. 20世纪50年代末至60年代提出中心法则和操纵子学说，并破译遗传密码，阐明遗传信息的流动和表达。

  • DNA体外切割、连接和测序技术直接推动了重组DNA技术的发展。

  • 重组DNA的核心

    用限制性内切核酸酶切割DNA，再用DNA连接酶连接不同DNA片段。

  • DNA连接酶

    • 1967年由5个实验室几乎同时报道。
    • 通过形成相邻核苷酸间的磷酸二酯键，既可修复DNA缺口，也可连接完全分离的DNA片段。

  • 限制性内切核酸酶

    • 1972年，Boyer实验室发现EcoR I可特异识别GAATTC并切开双链DNA，产生黏性末端。
    • 不同来源、经EcoR I切割的DNA片段可由DNA连接酶相互连接。
    • 多数限制酶识别回文序列并产生黏性末端。
    • 少数识别非回文序列，如Bsa I；部分产生平末端，如Pvu II。

常用限制性内切核酸酶的识别序列和切割位点


重组DNA技术的重要节点·

时期 主要事件
1869年 Miescher首次分离DNA
1957年 Kornberg从大肠杆菌中发现DNA聚合酶I
1961—1966年 首个遗传密码被破译、操纵子模型提出、基因与多肽的共线性得到证明，随后全部遗传密码被破译
1967年 首次发现DNA连接酶
1970年 分离第一种限制性内切核酸酶；从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶
1972—1973年 获得首个重组DNA分子，完成首例细菌基因克隆
1975—1977年 建立DNA测序技术，并完成全长5 387 bp的噬菌体基因组测序
1978年 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素
1981—1983年 获得转基因小鼠、果蝇和第一例转基因植物；基因工程胰岛素获准使用
1996年 完成酵母基因组全序列测定，教材列为 $1.25\times10^7\ \mathrm{bp}$
2000年 完成拟南芥全基因组序列测定，教材列为 $1.2\times10^8\ \mathrm{bp}$
2001年 完成人类基因组全序列测定，教材列为 $2.7\times10^9\ \mathrm{bp}$
2012年 首次报道CRISPR/Cas9基因编辑体系

分子克隆载体·

  • 大多数DNA片段不能自主复制，必须与能够在宿主内复制的DNA分子连接，才能随宿主繁殖。

  • 载体（vector）

    具有自主复制能力，可携带外源DNA进入宿主并使其繁殖的DNA分子。

  • 病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子均可作为载体。

常见质粒载体·

载体 主要组成或标志 复制与应用特点
pSC101 全长9.09 kb；含四环素抗性基因 $tet^r$；有7种限制酶的单切位点 第一代质粒载体；严紧型复制控制；每个宿主细胞约1～2个拷贝，难以大量提取
ColE1 教材本段未详列筛选标志 松弛型复制控制；每个宿主细胞约1 000～3 000个拷贝
pBR322 $amp^r$ 来自pSF2124质粒转座子Tn3；$tet^r$ 来自pSC101；复制起点ori来自ColE1派生质粒pMB1 每个细胞约1 000～3 000个拷贝，便于制备重组DNA
pUC pBR322的ori、$amp^r$、$lacZ$ 启动子及编码α肽的 $lacZ’$ $lacZ’$ 的 $5’$ 端含多克隆位点，可进行蓝白斑筛选
  • pSC101在HindⅢ、BamH I或Sal I位点插入外源DNA时，$tet$ 会失活。

pSC101质粒载体

ColE1质粒载体

pBR322质粒载体

pUC18质粒载体


蓝白斑筛选·

  • $lacZ’$ 编码β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸组成的α肽。
  • 无外源DNA插入
    1. IPTG诱导 $lacZ’$ 表达。
    2. α肽与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶互补。
    3. 产生有活性的β-半乳糖苷酶，水解X-gal并生成蓝色产物。
    4. 菌落呈蓝色。
  • 有外源DNA插入
    1. 外源DNA插入 $lacZ’$ 的多克隆位点。
    2. $lacZ’$ 功能被破坏，不能完成α互补。
    3. 菌落呈白色。

蓝色表示 $lacZ’$ 未被插入破坏，白色表示含重组DNA。教材末句将蓝色菌落写为“非转化菌落”，与同段所述α互补机制的称谓不一致。


细菌转化与早期重组实验·

  • 1970年，Mandel和Higa发现，经适量 $CaCl_2$ 处理的大肠杆菌可有效吸收 $\lambda$ 噬菌体DNA。

  • 1972年，又证明经 $CaCl_2$ 处理的大肠杆菌可摄取质粒DNA，大肠杆菌由此成为分子克隆中最常用的转化受体。

  • Berg等的重组实验（1972年）

    • 用EcoR I分别消化SV40和 $\lambda$ 噬菌体DNA。
    • 用T4 DNA连接酶连接片段。
    • 首次获得同时含SV40和 $\lambda$ 噬菌体DNA的重组分子。

  • Cohen实验室的重组实验（1973年）

    • 将含卡那霉素抗性基因的R6-5质粒片段与含四环素抗性基因的pSC101片段连接。
    • 所得重组质粒同时表现卡那霉素和四环素抗性。

  • 跨物种表达实验

    • 将非洲爪蟾核糖体蛋白基因片段与pSC101重组并导入大肠杆菌。
    • 动物基因能够进入原核细胞，并转录出相应mRNA。

早期实验确立了3点：质粒可作为外源DNA载体；高等生物基因可转移到原核细胞并表达；质粒—大肠杆菌可构成有效的基因克隆体系。

DNA基本操作技术·

基因组DNA的提取·

基因组的范围·

  • 广义基因组（genome）

    一个单倍体细胞内，细胞核、线粒体和叶绿体所含的全部DNA分子。

  • 通常所称的基因组DNA

    细胞核染色体上，包括编码区和非编码区在内的全部DNA。

  • 获取高相对分子质量、高纯度的基因组DNA，可提高PCR、Southern杂交、文库构建和基因组测序结果的可靠性。


提取流程与试剂作用·

  1. 破碎材料
    • 植物组织有细胞壁，通常先用液氮速冻并研磨。
    • 动物组织和细胞一般直接加入裂解液。
  2. 裂解细胞并释放染色质
    • SDS：阴离子去污剂，常用于动物材料；溶解细胞膜、使蛋白质变性并释放DNA。
    • CTAB：阳离子去污剂，常用于植物材料；有利于除去多糖、溶解细胞膜并与核酸形成复合物。
  3. 有机相抽提
    • 苯酚和氯仿使蛋白质、糖类及酚类等有机成分与水相中的DNA分离。
  4. 沉淀和洗涤DNA
    • 教材称乙醇可吸收与DNA结合的水分子，使DNA沉淀并进一步纯化。
  5. 溶解和保存
    • 沉淀晾干后，溶于超纯水或TE缓冲液。
    • 可在 $4\ ^\circ\mathrm{C}$ 适当保存，但宜尽快使用。
  • 硅胶膜柱纯化
    • 使DNA吸附于硅胶膜，与其他成分分开。
    • 再在低盐条件下直接洗脱，可获得纯度较高的DNA。

基因组DNA提取流程及样品电泳


浓度、纯度与完整性检测·

指标 教材给出的判断
$OD_{260}=1$ DNA浓度约为 $50\ \mu\mathrm{g/mL}$
$OD_{260}/OD_{280}=1.8\sim2.0$ 纯度较好
$OD_{260}/OD_{280}<1.8$ 提示蛋白质或酚污染
片段大小 应显著大于50 kb；操作中应尽量避免机械剪切
  • 可用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。
  • 教材以约50 kb的 $\lambda$ 噬菌体DNA作为基因组DNA质量参照。

核酸凝胶电泳·

分离原理·

  • 核酸的磷酸基团在生理条件下离子化，使核酸带负电并在电场中由负极向正极迁移。
  • 相同数量的双链DNA所带净电荷近似相等。
  • 在一定电场和凝胶条件下，DNA迁移率主要取决于片段大小，因此不同大小的核酸可被分离。

琼脂糖凝胶电泳装置


凝胶类型与分辨范围·

  • 凝胶浓度越高，孔隙越小，越适合分辨较小片段；浓度越低，孔隙越大。
凝胶类型及浓度 分离DNA片段范围
琼脂糖凝胶总体 $0.2\sim50\ \mathrm{kb}$
0.3%琼脂糖 $1,000\sim50,000\ \mathrm{bp}$
0.7%琼脂糖 $1,000\sim20,000\ \mathrm{bp}$
1.4%琼脂糖 $300\sim6,000\ \mathrm{bp}$
4.0%聚丙烯酰胺 $100\sim1,000\ \mathrm{bp}$
10.0%聚丙烯酰胺 $25\sim500\ \mathrm{bp}$
20.0%聚丙烯酰胺 $1\sim50\ \mathrm{bp}$
  • 溴化乙锭（EB）检测
    • EB可插入DNA或RNA的相邻碱基之间。
    • 在300 nm紫外光下发出荧光。
    • 教材称可检测约50 ng的DNA条带。

脉冲电场凝胶电泳·

  • 普通琼脂糖凝胶难以分离大于50 kb的DNA。

  • 脉冲电场凝胶电泳（PFGE）

    通过周期性改变电场方向、电流大小和作用时间，分离超大DNA片段，甚至整条染色体。

  • 机制

    1. 电场方向周期性变化，DNA必须不断改变构型和迁移方向。
    2. 大DNA比小DNA需要更多脉冲才能完成方向调整。
    3. 不同大小DNA因调整速度不同而被分离。

  • PFGE可分离高达 $10^7\ \mathrm{bp}$ 的DNA分子。

脉冲电场凝胶电泳中DNA迁移方向的变化


聚合酶链式反应·

  • 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）

    在体外快速扩增特定DNA片段的常用方法，由Kary Mullis于20世纪80年代发明。

  • 模板可以是

    • 质粒DNA
    • 基因组DNA
    • mRNA反转录产生的cDNA

  • 基本反应体系

    • 模板DNA
    • 一对单链DNA引物
    • 4种dNTP
    • 耐高温DNA聚合酶
    • 反应缓冲液

  • 引物

    与目标区段两端互补的一小段单链DNA；提供局部双链起点，引导DNA聚合酶特异扩增两引物之间的序列。

  • DNA聚合酶从引物的 $3’$ 端开始合成互补链；一对引物分别结合目标区段两端，使两条新链朝相反方向延伸。

一个PCR循环·

步骤 条件变化 结果
变性 高温处理模板DNA 双链DNA分开成为单链
退火 适当降低温度 引物与模板上的互补序列结合
延伸 DNA聚合酶发挥作用 从引物 $3’$ 端合成新的互补链
  • 每轮产生的新DNA又可作为下一轮模板，因此扩增可连续重复。
  • 经 $n$ 轮循环，两引物之间目标区段的理论最大拷贝数为

$$ 2^n $$

  • 教材称PCR可在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。
  • 图5-8第15轮的拷贝数列为32 788，与教材同时给出的 $2^n$ 规律及相邻数列不一致。

PCR变性、退火和延伸循环


重组载体构建·

常规酶切—连接法·

  • 引物设计参数
    • 长度一般为18～27 bp。
    • GC含量为40%～60%。
    • $T_m$ 值约为 $60\ ^\circ\mathrm{C}$。
    • 两条引物的 $5’$ 端分别加入酶切位点和保护碱基。
    • 所选位点必须与载体的多克隆位点匹配。

教材正文此处称“外切核酸酶识别位点”，但本章前文及图5-9均按限制性内切核酸酶和双酶切描述，两处术语口径不一致。

  • 构建流程

    1. 设计并合成含酶切位点的引物。
    2. 选择模板和DNA聚合酶，用PCR扩增目的基因。
    3. 用琼脂糖凝胶电泳检查产物。
      • 条带单一：直接用硅胶膜柱纯化PCR产物。
      • 条带不单一：在紫外灯下切取目标条带，溶胶后再用硅胶膜柱纯化。
    4. 用相同的两种酶分别消化目的片段和载体DNA。
      • 根据DNA总量，酶切10 min至数小时，保证反应完全。
    5. 用T4 DNA连接酶连接目的片段和载体。
      • 插入片段与载体DNA的摩尔比以 $(8\sim10):1$ 较有利。
    6. 将连接产物转化入大肠杆菌，扩增并筛选重组载体。

  • T4 DNA连接条件

温度 时间 教材所述特点
$22\ ^\circ\mathrm{C}$ 1～2 h 酶活性较高，但较易失活，连接稳定性较低
$4\ ^\circ\mathrm{C}$ 或 $16\ ^\circ\mathrm{C}$ 通常8 h以上 酶活性维持较久，连接后较稳定

常规重组载体的构建


恒温一步法·

  • 特点：不依赖T4 DNA连接酶，在同一温度下完成末端处理、退火、补缺和封口。
  • 流程
    1. 将载体线性化。
    2. 通过引物设计，在插入片段两端引入与线性化载体末端相同的15～25 bp序列。
    3. PCR扩增插入片段，将其与线性化载体按一定比例混合，并加入dNTP。
    4. T5外切核酸酶消化DNA片段的 $5’$ 端，形成单链突出部分。
    5. 插入片段与载体的同源末端重新退火。
    6. DNA聚合酶填补退火双链两侧的缺口。
    7. Taq DNA连接酶封闭缝隙。
    8. 在 $50\ ^\circ\mathrm{C}$ 恒温反应15～30 min，完成连接。

恒温一步法构建重组载体

  • 两种构建方法比较
项目 常规酶切—连接法 恒温一步法
插入片段末端设计 加入与载体MCS匹配的酶切位点和保护碱基 加入与线性化载体末端相同的15～25 bp序列
主要酶 限制性核酸酶、T4 DNA连接酶 T5外切核酸酶、DNA聚合酶、Taq DNA连接酶
连接依据 酶切后形成的相容末端 插入片段与载体末端的同源序列
反应条件 按酶切、连接分步进行；连接需1～2 h或8 h以上 $50\ ^\circ\mathrm{C}$ 恒温15～30 min

细菌转化、筛选与质粒提取·

  • 感受态细胞

    经 $CaCl_2$ 处理后膨胀、膜通透性改变，较易吸附和摄取外源DNA的大肠杆菌细胞。

  • 转化流程

    1. 将连接产物与感受态细胞混匀，冰上静置30 min。
    2. 转至 $42\ ^\circ\mathrm{C}$ 热刺激30～90 s，使连接产物可能被细胞吸收。
    3. 在 $37\ ^\circ\mathrm{C}$ 摇床复苏约1 h。
    4. 均匀涂布于含抗生素的培养基。
    5. 在 $37\ ^\circ\mathrm{C}$ 培养箱中倒置过夜培养。

  • 重组质粒带有抗性基因和表达元件，使成功转化的细胞可在相应抗生素培养基中存活。

  • 鉴定与制备流程

    1. 随机挑取单菌落，直接以菌内重组质粒为模板进行菌落PCR。
    2. 将阳性菌落接种液体培养基，在 $37\ ^\circ\mathrm{C}$ 培养10～13 h。
    3. 用强碱裂解细菌，释放质粒DNA。
    4. 加酸中和并离心，收集上清。
    5. 用硅胶膜柱纯化质粒DNA。
    6. 经酶切和测序确认序列无误后，用于后续实验。

细菌转化、重组克隆筛选及质粒提取


实时定量PCR·

基本原理·

  • 普通PCR的终点产物总量变异系数可达10%～30%，因此仅测终产物难以可靠定量。

  • 实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）

    用带荧光检测功能的PCR仪连续监测扩增过程中DNA的累积速率，从而减少终点定量带来的误差。

  • 荧光探针预先加入反应液；随着新生DNA增加，与DNA相关的荧光信号也增加。


SYBR Green I与TaqMan探针·

项目 SYBR Green I TaqMan探针
识别方式 非序列特异性，只与双链DNA结合 与靶DNA中部的特定序列互补
教材所列结构 荧光染料，激发波长520 nm 一段单链DNA，两端分别带短波长和长波长荧光基团
初始状态 与双链DNA结合后产生荧光 两基团距离近，因FRET发生荧光淬灭
扩增时的信号 反映体系内全部双链DNA Taq DNA聚合酶的外切酶活性逐步降解已结合探针，使两基团分离并解除淬灭
特异性 不能区分不同双链产物 荧光主要反映特定靶DNA的累积
  • 教材将TaqMan探针长度记为50～150 bp，虽描述对象为单链DNA，仍沿用原文单位。

SYBR Green I检测实时PCR产物

TaqMan探针的淬灭与荧光释放


实验设计与Ct值·

  • 每次实验应设置

    • 阴性对照
    • 4个以上由已知浓度DNA依次稀释得到的标准品
    • 每个样品至少3个平行重复

  • 教材称通常以最初10～15个循环的荧光值作为“阈值或基线”，也可用阴性对照的最高荧光值作为基线；后文则将阈值作为定义Ct的判定线，术语使用并不完全一致。

  • Ct值

    PCR产物荧光强度首次超过设定阈值时所需的循环数。

  • 绝对定量

    1. 以标准品DNA总量的 $\lg$ 值和对应Ct值建立标准曲线。
    2. 测得未知样品的Ct值。
    3. 通过标准曲线的线性回归计算靶DNA起始量。

  • 相对定量示例

    • 野生型拟南芥中WUS的平均Ct：$31.23\pm0.32$。
    • 突变体中WUS的平均Ct：$21.92\pm0.13$。
    • $\Delta Ct=9.31\pm0.19$。
    • 设扩增效率为1.8，则相对比值

$$ n=1.8^{\Delta Ct} $$

  • 突变体中WUS表达丰度比野生型提高 $239\pm26.25$ 倍。
  • 样品用拟南芥管家基因UBQ10进行均一化。

基因组DNA文库的构建·

  • 基因组DNA文库

    将某生物的基因组DNA切成适当片段，分别与载体重组并导入受体形成克隆；这些理论上覆盖全部基因组序列的克隆总汇。

  • 用途

    • 分离特定基因片段
    • 分析特定基因结构和表达调控
    • 构建全基因组物理图谱
    • 进行全基因组序列测定

代表性与克隆数·

  • 完整文库必须兼具代表性和随机性，使全部克隆所携带的片段能够覆盖整个基因组。

  • 提高代表性的两种策略

    1. 用机械法或限制性内切核酸酶法随机断裂DNA，保证克隆的随机性。
    2. 增加重组克隆数，提高基因组覆盖倍数。

  • Clark和Carbon公式

$$ N=\frac{\ln(1-p)}{\ln(1-f)} $$

符号 含义
$N$ 一个基因组文库应包含的重组克隆数
$p$ 期望靶基因在文库中出现的概率
$f$ 重组克隆平均插入片段长度与基因组DNA总长之比
  • 为获得完整基因簇或一个基因及其两侧序列，随机DNA片段一般约20 kb或更大。
  • 人基因组为 $3\times10^9\ \mathrm{bp}$、$p=99%$、平均插入片段为20 kb时

$$ N=6.9\times10^5 $$


$\lambda$ 噬菌体文库·

  • $\lambda$ 噬菌体载体的克隆容量为15～20 kb，常与限制性内切酶部分消化法配合。
  • Sau3A与BamH I为同尾酶，因此Sau3A产生的基因组DNA片段可插入经BamH I消化的 $\lambda$ 载体。
  • 构建流程
    1. 提取真核生物基因组DNA，用识别4个核苷酸的Sau3A部分消化。
    2. 经琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心，收集15～20 kb片段。
    3. 用BamH I消化 $\lambda$ 噬菌体载体DNA。
    4. 用T4 DNA连接酶连接载体和基因组片段。
    5. 对重组分子进行体外包装。
    6. 感染大肠杆菌，形成噬菌斑并组成基因组文库。
  • 优点：构建简单、高效，且易用分子杂交法筛选；广泛用于细菌、真菌等基因组较小物种。

利用Sau3A和BamH I同尾末端构建基因组DNA文库


高容量载体·

载体 插入容量 教材所述特点或用途
柯斯质粒 可达45 kb 稳定性相对较差，多次复制时易发生缺失
BAC、PAC、YAC 70～1 000 kb 主要用于基因组作图、测序和克隆序列比对

RNA基本操作技术·

RNA操作概述·

  • 真核生物基因组庞大且含大量重复序列，很难直接用电泳或杂交分离靶基因。

  • cDNA（complementary DNA）

    以mRNA为模板，经反转录形成的互补DNA。

  • cDNA不含教材所称的冗余序列，可通过特异性探针筛选cDNA文库，较快分离相关基因。

  • 单链RNA不稳定、易降解，且在自然状态下难以扩增；因此常将mRNA反转录为稳定的双链DNA，再插入可自主复制的载体。

  • 高质量cDNA文库代表某一器官或组织mRNA所携带的全部或绝大部分遗传信息。

  • 基因组DNA文库与cDNA文库

项目 基因组DNA文库 cDNA文库
起始材料 某生物的全部基因组DNA 某器官或组织的mRNA
克隆内容 理论上覆盖基因组全部序列 反映该样品中已表达mRNA的信息
序列特点 同时包含编码区和非编码区 教材称不含冗余序列
主要用途 基因结构、调控、物理图谱和全基因组测序等 目的基因筛选、测序、基因芯片杂交等

总RNA的提取·

总RNA的组成与操作要求·

  • 总RNA包括编码蛋白质的mRNA，以及rRNA、tRNA等非编码RNA。
  • 一个典型动物细胞约含 $10^{-5}\ \mu\mathrm{g}$ RNA。
RNA类型 教材所列占总RNA比例
rRNA 80%～85%
tRNA及其他非编码RNA 15%～20%
mRNA 1%～5%
  • 上述比例范围由教材分别给出，上、下限不能直接相加为严格的100%。
  • 28S和18S rRNA两条特征带是判断总RNA纯度与完整性的重要指标。
  • mRNA呈单链，易受核酸酶攻击；RNA操作比DNA操作更严格。
  • 实验环境、器皿和溶液均应避免RNase污染。

异硫氰酸胍—苯酚抽提法·

  • Trizol是常用的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成。

  • 作用

    • 迅速破坏细胞结构，释放细胞质和细胞核中的RNA。
    • 使核糖体蛋白与RNA分离。
    • 保护RNA完整性。

  • 基本流程

液氮研磨、匀浆 → 加Trizol进一步裂解 → 氯仿抽提 → 离心分相 → 收集含RNA的水相 → 异丙醇沉淀总RNA

  • 也可使细胞裂解液通过硅胶膜柱进行纯化。
  • 植物组织中的酚类、多糖或其他次生代谢物可能干扰RNA提取，应根据材料特点预先去除。

总RNA提取流程及样品电泳


RNA质量检测·

指标 教材给出的判断
$OD_{260}=1$ RNA浓度为 $50\ \mu\mathrm{g/mL}$
$OD_{260}/OD_{280}=1.8\sim2.0$ 纯度较好
$OD_{260}/OD_{280}<1.8$ 提示蛋白质或酚污染
$OD_{260}/OD_{280}>2.0$ 教材称RNA可能发生降解
  • 琼脂糖凝胶电泳全过程也必须避免RNase污染。
  • 质量较好的RNA应表现为
    • 28S和18S rRNA大小完整。
    • 28S与18S rRNA条带亮度接近 2:1。
    • mRNA分布均匀。

mRNA的纯化·

  • 真核mRNA的显著结构特征
    • $5’$ 端有 $m^7G$ 帽子。
    • $3’$ 端有poly(A)尾。
  • poly(A)尾是从总RNA中选择性分离真核mRNA的标志。

oligo(dT)-纤维素柱法·

  1. 使总RNA流经oligo(dT)-纤维素柱。
  2. 在高盐缓冲液中，mRNA的poly(A)尾与oligo(dT)结合并被保留在柱上。
  3. 未结合的RNA被洗去。
  4. 改用低盐溶液或蒸馏水，洗脱mRNA。
  5. 连续经过两次oligo(dT)-纤维素柱，可获得纯度较高的mRNA。

磁珠法·

  1. 将生物素标记的oligo(dT)与总RNA温育，使其与poly(A)尾结合。
  2. 加入连接于微磁球的抗生物素蛋白，捕获生物素标记的复合物。
  3. 用磁场吸附微磁球，从总RNA中分离poly(A) mRNA。

利用poly(A)尾分离纯化mRNA


cDNA的合成·

第一链cDNA·

  • 以mRNA为模板，在反转录酶催化下合成第一链cDNA。
  • 常以oligo(dT)为引物
    • 一般含12～20个脱氧胸腺嘧啶核苷酸。
    • 后接一个连接序列，通常含Xho I等酶切位点，便于后续克隆。

cDNA第一链和第二链的合成


第二链cDNA·

  1. RNase H切割mRNA-cDNA杂合体中的mRNA链。
  2. 产生的RNA小片段作为引物。
  3. DNA聚合酶以第一链cDNA为模板，合成第二链DNA片段。
  4. DNA连接酶连接这些片段，形成完整双链cDNA。

定向cDNA的构建·

  • 应选择活性较高的反转录酶，并在cDNA两端引入不同限制酶识别的接头，使插入具有方向性。
  • 流程
    1. 在反应中加入甲基化dCTP，使新生cDNA受到甲基化修饰。
    2. 甲基化保护cDNA内部相应位点，避免后续构建时被限制性内切核酸酶切开。
    3. 第二链合成完成后，连接含另一酶切位点的黏性接头，如EcoR I接头。
    4. 再用Xho I酶切，使双链cDNA的 $5’$ 端和 $3’$ 端分别具有EcoR I和Xho I黏性末端。
    5. cDNA只能按固定方向连接到具有相应末端的载体。
  • 教材称大多数大肠杆菌会切除含5’-甲基胞嘧啶的外源DNA，因此常选用 $mcrA-mcrB-$ 菌株，防止cDNA被降解。

不同的两端黏性序列决定插入方向，是定向cDNA克隆的关键。

定向cDNA合成及分子修饰


cDNA文库的构建·

  • cDNA长度一般为0.5～8 kb，普通质粒和噬菌体类载体均可容纳；具体载体应根据文库用途选择。

  • Uni-ZAP XR载体

    • 属于 $\lambda$ 噬菌粒载体，可容纳0～10 kb插入片段。
    • 兼具噬菌体感染效率高和质粒蓝白斑筛选方便的特点。
    • 内含pBluescript载体的全部序列。
    • 重组后可经体内剪切反应，将cDNA插入片段转入质粒系统，用于筛选、克隆和测序。

  • 文库形成

    1. 含cDNA的重组噬菌粒经体外蛋白质外壳包装，形成有侵染和复制能力的成熟噬菌体。
    2. 用包装后的噬菌体感染大肠杆菌，并涂布于琼脂平板。
    3. 每个重组噬菌体形成一个独立噬菌斑。

  • DNA和蛋白提取物的浓度、体积比、反应温度和时间都会影响包装效率，进而影响侵染能力。

  • 一个较完整的cDNA文库通常含 $>5\times10^5$ 个独立克隆。

  • 用途

    • 筛选目的基因
    • 大规模测序
    • 基因芯片杂交

基因文库的筛选·

  • 基因文库筛选

    用特定方法从文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的克隆。

方法 识别依据 主要前提 适用特点
核酸杂交法 探针与目的核酸互补 具有特异DNA或RNA探针 适用广、速度快，可筛菌落或噬菌斑
PCR筛选法 特异引物扩增目的序列 已知足够的序列信息 通用、操作简单，可逐级缩小阳性克隆范围
免疫筛选法 抗原—抗体特异结合 文库能表达外源蛋白，且有特异性抗体 即使基因序列未知，也可按产物筛选

核酸杂交法·

  1. 将平板上的菌落复制到硝酸纤维素膜，同时保留原平板。
  2. 温育后用碱液裂解菌落并使DNA变性。
  3. 用蛋白酶K除去蛋白质，形成菌落DNA印迹。
  4. 在 $80\ ^\circ\mathrm{C}$ 烘烤，将DNA固定在膜上。
  5. 加入放射性标记的DNA或RNA探针进行杂交。
  6. 放射自显影后，X光底片上的黑斑代表阳性克隆。
  7. 按位置从原平板找到并挑取对应克隆。
  • 噬菌斑也可直接印到膜上。
  • 同一噬菌斑平板可连续复制多张膜，并分别用不同探针筛选，以提高可靠性。

核酸杂交法筛选目的克隆


PCR筛选法·

  1. 将完整文库以质粒或菌落形式保存在多孔培养板中。
  2. 用目的基因特异性引物对每个孔进行PCR。
  3. 找出阳性孔。
  4. 将阳性孔中的克隆稀释并转入次级多孔板。
  5. 重复PCR筛选，直至获得与目的基因对应的单个克隆。

免疫筛选法·

  • 仅适用于用表达载体构建、各克隆能够在宿主内产生所编码蛋白质的表达文库。
  • 流程

菌落或噬菌斑印膜 → 原位裂解释放抗原蛋白 → 特异性抗体结合抗原 → 标记二抗结合 → 检测标记信号 → 定位阳性克隆

免疫化学法筛选噬菌体表达文库


非编码RNA研究·

  • 非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）

    不编码蛋白质的一大类RNA。

  • 高等真核生物基因组中，蛋白质编码区只占少部分，而一半以上DNA可被转录，因此大部分RNA不编码蛋白质。

类型 代表 教材所述主要作用
组成型ncRNA rRNA、tRNA 构成蛋白质合成机器的重要组分
调节型ncRNA miRNA、siRNA、piRNA、snRNA、snoRNA、lncRNA、circRNA等 在转录或翻译水平调控表达，维持基因组稳定，参与细胞功能和命运决定
  • ncRNA通常没有mRNA所具有的标志性poly(A)尾，不能直接用oligo(dT)分离。
  • 目前主要根据ncRNA的大小和形态结构进行分离。

不同非编码RNA的分离策略


小于50 nt的短ncRNA·

  • 适用对象：miRNA、siRNA、piRNA等通常小于50 nt的ncRNA。
  • 流程
    1. 提取总RNA。
    2. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离小于50 nt的RNA。
    3. 切胶回收，以糖原和乙酸钠为助沉剂进行乙醇沉淀；也可用专门吸附小RNA的硅胶膜柱。
    4. 用T4 RNA连接酶在RNA的 $3’$ 端连接寡核苷酸，如poly(dA)。
    5. 用反转录酶合成第一链cDNA，再用DNA聚合酶形成双链cDNA。
    6. 用A尾酶在双链cDNA的 $3’$ 端加一个dAMP。
    7. 将带一个dTMP的接头引物连接到双链cDNA两端。
    8. PCR扩增，用于测序或文库构建。

去除rRNA和tRNA后分析其他ncRNA·

  1. 合成rRNA和tRNA特异、生物素标记的寡核苷酸探针。
  2. 使探针分别与rRNA和tRNA杂交。
  3. 用偶联链霉亲和素的磁珠捕获带生物素的杂合分子。
  4. 用磁铁移除磁珠，从而排除两类组成型RNA。
  5. 将剩余RNA随机打断成教材所记的200～300 bp片段。
  6. 用随机六聚体引物N6反转录合成cDNA并测序。
  7. 所得信息同时包含mRNA和ncRNA；根据起始子、终止子、可读框和剪接位点等mRNA特征将其分离去除。
  8. 再依据不同ncRNA的结构特征，用软件归类分析。

circRNA的分离·

  • circRNA具有闭合环状结构，可利用其抵抗线性RNA外切降解的特点进行富集。
  • 流程
    1. 从总RNA中去除rRNA和tRNA。
    2. 用具有 $3’$ 端核糖核酸外切酶活性的RNase R降解单链线性RNA。
    3. mRNA和线性ncRNA被除去，环状RNA保留。
    4. 将circRNA随机打断。
    5. 以N6为引物反转录，再进行建库和测序。

基因克隆技术·

克隆的不同层次·

层次 含义 教材举例
个体克隆 由基因型相同的同一物种两个或多个个体构成的群体 同一受精卵分裂形成的单卵双生子
细胞克隆 由同一个祖细胞分裂形成、遗传物质完全相同的一群子细胞 教材未另举例
分子克隆 将外源DNA插入可复制载体，使其得到长期保存和复制 基因或cDNA片段的载体克隆
  • 真核基因组复杂，实验中常从mRNA制备cDNA文库，再从中筛选目的基因。
  • 教材数据
    • 高等生物可有30 000～50 000个不同基因。
    • 某一时间段的单个细胞或组织仅约15%的基因表达。
    • 可产生约5 000～10 000种不同mRNA，使cDNA文库筛选相对简化。

RACE技术·

  • cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）

    在已知部分cDNA序列的基础上，克隆其缺失的 $5’$ 端或 $3’$ 端序列。

  • 已知序列可来自

    • 序列表达标签
    • 减法cDNA文库
    • 差式显示
    • 基因文库筛选

教材正文的RNA接头路线·

  1. 获得高质量总RNA
    • 其中含完整mRNA、tRNA、rRNA及部分不完整mRNA。
  2. 去磷酸化
    • 带 $5’$ 帽子结构的完整mRNA不受影响。
  3. 去帽并连接RNA接头
    • 去除mRNA的 $5’$ 帽子。
    • 加入特异RNA寡聚接头，由RNA连接酶连接。
  4. 反转录
    • 以特异性oligo(dT)为引物合成第一链cDNA。
    • 所得cDNA含RNA接头的互补序列。
  5. 分别进行末端扩增
    • $5’$ RACE：用RNA接头的部分序列作上游引物，以基因特异性反向引物作下游引物，扩增基因 $5’$ 端。
    • $3’$ RACE：用基因特异性正向引物和oligo(dT)下游接头序列作引物，扩增基因 $3’$ 端。
    • 若只研究 $3’$ 端，可跳过去磷酸化和去帽步骤，直接从反转录开始。
  6. 克隆与测序
    • 纯化PCR产物，克隆入载体并进行序列分析。

图5-23所示的另一条 $5’$ RACE路线·

  1. 用基因内部特异性引物GSP1，在反转录酶作用下合成第一链cDNA。
  2. 用RNase混合物降解模板mRNA，并纯化cDNA。
  3. 用末端转移酶在cDNA的 $3’$ 端连续加入dCTP，形成oligo(dC)尾。
  4. 以教材所称“连有oligo(dC)的锚定引物AP”和内侧基因特异性引物GSP2进行巢式PCR，获得目的基因 $5’$ 端。
  • 教材在前一步形成的cDNA尾和AP组成中均写oligo(dC)，但未解释二者的配对关系。

图示的5' RACE流程


图5-23所示的 $3’$ RACE路线·

  1. 以带接头AP、可与mRNA poly(A)尾配对的锚定oligo(dT)为引物，合成第一链cDNA。
  2. 用RNase降解模板mRNA。
  3. 用锚定引物AP和基因内部特异性引物GSP进行PCR，获得目的基因 $3’$ 端。

图示的3' RACE流程

教材正文采用“去帽后连接RNA接头”的 $5’$ RACE路线，图5-23则采用“cDNA末端加oligo(dC)尾”的路线；二者是不同方案，不能拼接为同一个连续流程。

  • 教材列出的RACE用途
    • 获得全长cDNA。
    • 获得教材所称的 $5’$ 和 $3’$ 端“非转录序列”。
    • 研究转录起始位点的不均一性。
    • 研究启动子区的保守性。

RAMPAGE技术·

  • 教材称，可变的启动子选择是基因在不同组织特异性表达的根本原因。
  • RAMPAGE（RNA annotation and mapping of promoters for the analysis of gene expression）

    在CAGE和RACE基础上建立的技术，可在全基因组范围鉴定蛋白质编码基因及部分ncRNA基因的转录起始位点，定位启动子，并高通量检测基因表达水平。

反转录与锚定接头引入·

  1. 从总RNA中去除rRNA和tRNA。
  2. 用带接头序列的随机引物进行反转录，同时加入教材所称末端带“3个鸟嘌呤核糖核苷酸（GTP）”的锚定引物。
  3. 加入山梨醇和海藻糖，提高反转录酶的热稳定性。
  4. 将反转录温度由 $42\ ^\circ\mathrm{C}$ 提高至 $55\sim60\ ^\circ\mathrm{C}$。
    • 有利于解开RNA模板二级结构。
    • 可削弱RNA $5’$ 端GC含量较高区域的牢固结构，使反转录延伸至RNA $5’$ 端帽结构处。
  5. 反转录酶的末端转移酶活性使cDNA的 $3’$ 端加上教材所称“3个胞嘧啶脱氧核苷酸（dCTP）”；RNA的 $5’$ 帽结构有利于这一添加。
  6. 末端带3个G的锚定引物使反转录产生的cDNA获得锚定序列。

教材用dCTP和GTP描述已经加入链端或引物末端的核苷酸，术语口径可疑，以上按原文保留。

帽端RNA-cDNA双链的富集·

  1. 用 $NaIO_4$ 氧化RNA $5’$ 帽结构和 $3’$ 端的二醇基团，使其形成醛基。
  2. 使醛基与长臂生物素酰酐反应，在RNA帽端和 $3’$ 端加上生物素。
  3. 随机引物通常不恰好结合RNA $3’$ 末端，因此该端多保持单链。
  4. 用RNase I特异切割单链RNA，除去RNA $3’$ 端的生物素标记。
  5. 用偶联链霉亲和素的磁珠，捕获帽端仍带生物素的RNA-cDNA双链。
  6. 用RNase H降解磁珠上的RNA，分离出已带锚定序列的单链cDNA。

扩增与测序·

  1. 用锚定引物和随机引物所带接头序列进行PCR，获得双链cDNA。
  2. 用纳米级微球磁珠纯化并进行大小筛选。
  3. 选取含帽端序列、长度为200～700 bp的cDNA，进行高通量二代测序。

RAMPAGE技术流程


Gateway大规模克隆技术·

  • 大规模功能研究需要把大量开放读码框分别转入不同载体，用于
    • 蛋白质表达和抗体制备
    • 宿主细胞或植物转化
    • 表型分析和细胞内定位
    • 目的蛋白与其他分子的相互作用研究
  • 传统酶切—连接法难以满足大规模、平行克隆需求。
  • 教材将所需的大规模克隆系统概括为高效且不依赖特定载体和宿主。
  • Gateway技术

    利用 $\lambda$ 噬菌体的位点特异性DNA重组，使目的基因无需传统酶切—连接即可快速克隆，并在不同载体间平行转移。

TOPO反应：构建Entry克隆·

  1. 用PCR获得带CACC末端接头的目的基因。
  2. Entry载体上的CCCTT序列被拓扑异构酶识别并切开。
  3. 拓扑异构酶第274位Tyr与切口磷酸基团形成共价键，使酶偶联于载体。
  4. 载体的 $3’$ 突出端GTGG与PCR产物的互补末端CACC配对。
  5. 目的基因按正确方向进入Entry载体。

LR反应：转移至表达载体·

  1. Entry载体中的目的基因两端具有attL1和attL2。
  2. 表达载体含attR1和attR2。
  3. 在重组蛋白作用下发生定向重组。
  4. 形成新的attB1和attB2位点，目的基因由Entry载体转入表达载体。

Gateway的TOPO反应与LR反应


基因的图位克隆法·

  • 图位克隆（map-based cloning）

    根据表型与遗传标记间的连锁关系，定位并分离序列未知的目的基因；理论上适用于具有可识别表型的基因。

基本流程·

  1. 构建遗传连锁图，将目的基因定位到染色体特定位点。
  2. 在目的基因两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。
  3. 分析多个不同生态型个体的限制性酶切和探针杂交结果。
  4. 找到与目的基因距离最近的两侧标记。
  5. 用染色体步移法分离并克隆两个标记之间的DNA片段。
  6. 按教材所述“基因功能互作原理”鉴定目的基因。

染色体步移法克隆基因


遗传距离与物理距离·

  • RFLP作图中的连锁距离由重组率计算，$1\ \mathrm{cM}$ 相当于1%的重组率。
物种 教材所列 $1\ \mathrm{cM}$ 对应的物理距离
人类 约1 000 kb
拟南芥 约290 kb
小麦 约3 500 kb

水稻BC1基因实例·

  • 水稻基因组较小，与其他单子叶植物具有较高共线性，且已有基因组序列和较完善的转化系统，因而成为单子叶植物功能基因研究的模式系统。
  • 图位克隆已用于分离水稻分蘖基因MOC1和脆杆基因BC1。
  • BC1定位过程
    1. 先将BC1定位于水稻3号染色体着丝粒区的C524a和RM16之间。
    2. 从7 068株bcl-2突变体 $F_2$ 植株中鉴定重组子。
    3. 最终将BC1定位于CAPS标记P2和P4之间的3.3 kb区段，并与P3共分离。
  • 图5-27中的BC1结构
    • 实心框表示编码区，空心框表示 $5’$ 和 $3’$ 非翻译区，框间连线表示内含子。
    • bcl-1和bcl-2表示两个脆杆突变体的突变位点。

水稻BC1基因的图位克隆


TAIL-PCR克隆T-DNA插入位点侧翼序列·

  • 热不对称交错PCR（thermal asymmetric inter-laced PCR，TAIL-PCR）

    常用于扩增T-DNA插入位点侧翼序列，为转基因植物插入位点提供特异性分子证据。

  • 引物

    • 一套巢式T-DNA边界特异性引物：TR1、TR2和TR3。
    • 一个短的随机简并引物：AD。

PCR I：建立特异性扩增优势·

  1. 先进行5轮高严谨性循环。
    • 仅TR1与模板退火。
    • T-DNA上游侧翼序列发生单引物线性扩增。
  2. 大幅降低退火温度。
    • AD和TR1均可与模板结合。
    • 进行一轮指数扩增。
  3. 此后交替进行2个高严谨性循环和1个低严谨性循环，共15个循环。
  • 产物关系
    • 特异性序列：两端分别有TR1和AD序列。
    • 非特异性序列I：只有TR1，没有AD序列。
    • 非特异性序列II：两端均为AD序列。
    • PCR I后，特异性序列和非特异性序列I显著多于非特异性序列II。

PCR II：降低背景·

  • 以TR2和AD为引物，进行12个TAIL-PCR循环。
  • 特异性序列再次优先扩增，非特异性序列I明显减少，此时已无明显背景片段。

PCR III：进一步富集目的片段·

  • 以TR3和AD为引物，进行20个常规PCR循环。
  • 进一步扩增T-DNA插入位点的特异性侧翼序列。

TAIL-PCR的三轮巢式扩增

蛋白质与蛋白质组学技术·

蛋白质组学概述·

  • 蛋白质组学

    研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件和特定时间所表达的全部蛋白质图谱。

比较 基因组 蛋白质组
稳定性 同一个体的全部细胞共享相对固定的基因组 随基因表达状态动态变化
影响因素 教材在本节强调其组成是确定的 随时间、空间和环境条件改变
组织差异 同一个体各细胞共同享有 不同器官、组织或细胞可具有不同蛋白质组

基因组相对固定，蛋白质组具有明显的时间、空间和环境动态性。

  • 蛋白质组学发展的技术基础
    • 蛋白质分离：改进的双向电泳和高效液相层析。
    • 蛋白质鉴定：现代质谱。
    • 信息基础：基因组学、生物信息学与蛋白质研究的交叉。

双向电泳技术·

  • 教材称双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）是分离大量混合蛋白质组分最有效的方法。
  • 2-DE依次依据蛋白质的等电点和相对分子质量进行分离。
方向 技术 分离依据 原理
第一向 等电聚焦（IEF） 等电点 蛋白质是两性分子，在pH梯度和电场中移动，最终聚集于各自等电点
第二向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 相对分子质量 SDS携带大量负电荷，使蛋白质自身电荷相对可忽略，迁移速度和距离主要由相对分子质量决定

2-DE：第一向按等电点分离，第二向按相对分子质量分离。

固相化pH梯度·

  • 固相化pH梯度（immobilized pH gradients，IPG）
    • 建立稳定、可精确设定的pH梯度。
    • 避免载体两性电解质向阴极漂移等问题。
    • 增大蛋白质上样量。
    • 提高双向电泳结果的重复性。
  • 随试剂改进，双向凝胶的最大分辨率可达到每块胶10 000个蛋白点。

拟南芥种子萌发48 h后的2-DE蛋白质图谱


荧光差异显示双向电泳·

  • 常规2-DE主要用于鉴定并建立特定时期的蛋白质表达谱。

  • 生物的蛋白质组会随个体、组织、细胞、发育阶段、分化状态以及生理或病理条件而变化，由此形成比较蛋白质组学。

  • 荧光差异显示双向电泳（2D-DIGE）

    在传统2-DE基础上结合CyDye多重荧光分析，使不同样本在同一块胶中分离和比较，降低系统误差并提高重复性与可信度。

最小标记法·

  1. 用3种荧光染料分别标记不同样本。
  2. 混合全部标记样本，在同一块胶中进行双向电泳。
  3. 对同一凝胶分别进行Cy2、Cy3和Cy5扫描。
  4. 用统计分析软件自动匹配蛋白点，并定量不同样本的差异。
  • 图5-30的样本标记
    • Cy2标记野生型和突变体的等量混合蛋白，作为蓝色内标。
    • Cy3标记突变体蛋白，显示绿色。
    • Cy5标记野生型蛋白，显示红色。
    • 绿色点表示野生型相对突变体下调，红色点表示野生型相对突变体上调。

野生型与突变体蛋白质的2D-DIGE比较

  • 2D-DIGE与常规银染的性能
性能 2D-DIGE 常规银染
单一蛋白质检测下限 25 pg 教材列为1～60 ng
浓度变化的线性动态范围 最多5个数量级 约2个数量级
  • 局限：不同荧光染料在不同激发波长下的荧光特性不同，低丰度蛋白质的定量仍较易出现偏差。

蛋白质质谱分析·

  • 用质谱鉴定电泳分离后的蛋白质，是蛋白质组学的重要技术突破。
  • 质谱仪由3个连续部分组成
    1. 离子源
    2. 离子分离区
    3. 检测器
  • 常用类型
    • 教材中文名记作“基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱”（MALDI-TOF）
    • 电喷雾质谱（ESI-MS）

MALDI-TOF原理·

  1. 将2-DE胶中分离所得或其他来源的蛋白质酶解成小肽段。
  2. 将肽段与以有机酸为主的基质混合。
  3. 把混合物点在金属靶表面，干燥并形成结晶。
  4. 用激光轰击靶面，使待测物以气态离子形式从表面喷出。
  5. 每个气态分子带一个或多个正电荷，在电场中加速并飞向检测器。
  6. 到达检测器所需时间取决于肽段的质荷比 $m/z$。

MALDI-TOF质谱仪原理


一级、二级质谱与蛋白质鉴定·

阶段 操作 结果与意义
样品制备 回收目标蛋白点，进行胰蛋白酶胶内酶解 获得酶解肽段
一级质谱 按质荷比 $m/z$ 和强度解析肽段 形成肽指纹图谱（PMF）；每个母离子峰代表一种肽段，峰强反映肽段多少
二级质谱 选择一级质谱中有代表性的母离子峰，以诱导碰撞解离（CID）方式打碎 形成肽段碎片指纹图谱（PFF）
数据鉴定 联合PMF与PFF进行数据库搜索 获得具体蛋白质鉴定信息

蛋白质一级和二级质谱鉴定结果

  • 质谱技术还可用于
    • 鉴定蛋白质复合物的组成。
    • 确定蛋白质翻译后修饰的类型和位点。
    • 研究磷酸化、硫酸化、糖苷化及其他修饰。

本章名词·

聚合酶链式反应｜polymerase chain reaction, PCR　⭐真题

是指通过模拟体内 DNA 复制方式在体外选择性地将 DNA 某个特定区域扩增出来的技术。

PCR｜PCR　⭐真题

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外快速扩增特定基因片段的技术。其原理是将模板DNA加热变性为单链，然后由耐高温DNA聚合酶在一对引物引导下，以单链为模板，利用四种脱氧核苷三磷酸合成新的互补链。通过重复高温变性、低温退火和中温延伸的循环，DNA片段实现指数级扩增。该技术是分子生物学中最常用的基因扩增方法。

DNA 重组技术｜recombinant DNA technology　⭐真题

又称基因工程 (genetic engineering), 指不同的 DNA 片段 (如某个基因或基因的一部分) 按照预先的设计定向连接起来, 在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达, 产生影响受体细胞的新的遗传性状的技术。

双向电泳技术｜Two-Dimensional Electrophoresis,2-DE　⭐真题

是一种依赖蛋白质的等电点和分子大小的性质,通过组合等电聚焦电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离大量混合蛋白质组分的技术。

cDNA｜complementary DNA

在体外以 mRNA 为模板, 利用反转录酶和 DNA 聚合酶合成的一段双链 DNA。

RACE｜rapid amplification of cDNA ends, cDNA 末端的快速扩增

利用 PCR 技术在已知部分 cDNA 序列的基础上特异性克隆其 5’ 端或 3’ 端缺失的序列。

共线｜Synteny

即相关物种的基因组在染色体水平上出现的同源现象。

引物｜primer

是指一段较短的单链 RNA 或 DNA, 它能与 DNA 的一条链配对提供游离的 3’-OH 末端以作为 DNA 聚合酶合成脱氧核苷酸链的起始点。

Mullis｜Mullis

Kary Mullis是一位美国生物化学家，于20世纪80年代在美国Cetus公司发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，该技术实现了体外快速扩增特定基因片段，对分子生物学研究产生了重大影响。

Yanofsky｜Yanofsky

Yanofsky是与Brener于1961年共同提出遗传密码三联子设想的科学家，该设想对遗传密码的破译及分子生物学的发展产生了重要贡献。

核小RNA｜small nuclear RNA

核小RNA（small nuclear RNA, snRNA）是一类存在于真核细胞核内的小分子非编码RNA，主要包括U1、U2、U4、U5和U6等，长度为100~300核苷酸。它们与特定蛋白质结合形成核小核糖核蛋白（snRNP），作为剪接体的核心组分参与前体mRNA的剪接过程，负责识别剪接位点、协助催化剪接反应。

基因扩增｜gene amplification

基因扩增是指特定基因的拷贝数在细胞内专一性大量增加的现象，是一种DNA水平上的基因表达调控方式。通过增加基因拷贝数直接增多转录模板，细胞在短期内大量合成相关蛋白质，以满足正常生长发育的需要或抵抗环境胁迫。在肿瘤细胞中，基因扩增事件发生频率极高，癌基因常作为扩增靶点，赋予肿瘤细胞选择性生长优势。

基因组DNA文库｜genomic DNA library

基因组DNA文库是将某种生物的基因组DNA切割成适当大小的片段，分别与载体连接后导入受体细胞，所形成的包含该生物基因组全部DNA序列（理论上每个序列至少有一份代表）的重组克隆总汇。它常用于分离特定基因片段、分析基因结构、研究基因表达调控，以及全基因组物理图谱构建和序列测定。构建时需保证文库的代表性和随机性，通常通过随机断裂DNA和增加克隆数目来实现。

菌落PCR｜colony PCR

菌落PCR是一种以菌落（或少量菌体）直接作为模板进行PCR扩增来快速筛选阳性克隆的方法。它无需提取质粒DNA，仅需用引物对菌落进行扩增，通过检测目标条带的有无来鉴定含目的基因的重组子，常用于基因文库筛选或重组载体构建后的阳性克隆鉴定。

克隆｜cloning

在分子生物学中，克隆是指将外源DNA片段插入具有复制能力的载体DNA中，使其能够永久保存和复制的过程。该技术是重组DNA技术的核心，常用于分离扩增特定基因、构建基因组文库等。

实时定量PCR｜real-time quantitative PCR

实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种在PCR反应过程中利用荧光信号实时监测DNA扩增累积速率并对初始模板进行定量的技术。该技术在带透明盖的塑料小管中进行，荧光探针预先混合于反应液中，仅在与DNA结合后才被激发产生荧光。随着目的DNA片段的合成增加，结合荧光探针增多，荧光信号相应增强，通过带荧光检测的PCR仪绘制动态变化图。该技术克服了传统PCR终点产物定量变异系数大的问题，实现了更精准的核酸定量。常用的非序列特异性荧光染料如SYBR Green I只能与双链DNA结合。

图位克隆法｜map-based cloning

图位克隆法是一种分离未知性状目的基因的方法，通过构建遗传连锁图将目的基因定位到染色体特定位点，并利用紧密连锁的分子标记（如RFLP或RAPD）确定其两侧边界；随后通过染色体步移技术克隆两个标记之间的基因片段，最后借助基因功能互补原理鉴定目的基因。

总RNA｜total RNA

总RNA（total RNA）是指细胞中所有RNA分子的集合，包括编码蛋白质的mRNA以及不编码蛋白质的非编码RNA（ncRNA），如rRNA、tRNA和其他调控RNA。其中rRNA含量最高，约占80%～85%，其电泳后呈现的28S和18S特征条带是评估总RNA纯度和完整性的关键指标。提取总RNA常用异硫氰酸胍-苯酚法（如Trizol试剂），操作中需严格避免RNA酶污染。

RAMPAGE 技术｜RNA Annotation and Mapping of Promoters for the Analysis of Gene Expression

是一种在全基因组范围内鉴定所有蛋白质编码基因和部分非编码 RNA 基因的转录起始位点, 确定启动子的具体位置, 并且能够高通量检测基因表达水平的方法。

RAPD｜Random Amplified Polymorphism, DNA 随机扩增多态性

DNA 序列上的微小变化, 甚至 1 个核苷酸的变化, 也能改变引物结合效率, 影响 PCR 扩增。

RFLP｜Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制性片段长度多态性

DNA 序列上的微小变化, 甚至 1 个核苷酸的变化, 也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。

实时定量 PCR｜real time quantitative PCR

是在 PCR 扩增过程中, 通过荧光信号对 PCR 进程进行实时检测, 监测整个 PCR 过程中扩增 DNA 的累积速率。依据指数时期模板的扩增循环数和该模板的起始拷贝数的线性关系, 可对特定 DNA 序列进行定量分析。

非编码 RNA｜non-coding RNA

是指从基因组上转录出来但不翻译成蛋白质的一类 RNA 的总称。依据功能不同, 主要分为两大类。一类是组成型的非编码 RNA, 包括 rRNA 和 tRNA; 另一类是调控型的非编码 RNA, 如 miRNA, siRNA, lncRNA 等。

基因克隆｜gene cloning

在分子生物学上,人们把将外源 DNA 插入具有复制能力的载体 DNA 中,转入宿主细胞使之得以永久保存和复制这种过程称为基因克隆。基因工程或重组 DNA 技术则侧重于验证上述过程所获得遗传物质新组合在宿主细胞内的表达与功能鉴定。

热不对称交错多聚酶链式反应｜Thermal Asymmetric Inter-Laced PCR

是一种用于扩增 T-DNA 插入位点侧翼序列, 从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据的技术。