核酸

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核酸·


核酸研究历史·


核酸的分类·

  • DNA
    • 真核
      • 98%位于核内
      • 2%位于核外
        • 线粒体 mDNA
        • 叶绿体 ctDNA
    • 原核
    • DNA病毒

  • RNA
    • mRNA
    • tRNA
    • rRNA
    • RNA病毒
    • 其他
      • snRNA
      • asRNA
      • miRNA
      • siRNA
      • smRNA
      • dsRNA
      • 其他小RNA

核酸的生物学功能·

  • 属性
    • 通过复制 来 传递遗传信息
    • 通过转录 来 控制生物表型
    • 通过突变 来 形成等位基因

  • RNA
    1. 遗传物质
    2. 参与蛋白质合成
    3. 遗传信息加工
    4. 调控基因表达及细胞功能
    5. 催化
    • rRNA（80%）
      • 组成核糖体，合成蛋白质
    • tRNA（15%）
      • 携带氨基酸，进行翻译
    • mRNA（3-5%）
      • 蛋白质的合成模板

核酸的结构·

核苷酸·

MP 5‘-磷酸（脱氧）核苷酸

  • 核苷酸
    • 磷酸
    • 核糖
      • 碱基
      • 戊糖

A（腺嘌呤） 6’上 氨基
G（鸟嘌呤）6’上 酮基，2’上 氨基 C（胞嘧啶） 2’上 酮基，4’上 氨基
U（尿嘧啶） 2’，4’上 酮基
T（胸腺嘧啶） 2’，4’上 酮基，5’上 甲基

  • 稀有核苷

    • 假尿苷（$\varphi$）
    • 二氢尿嘧啶（DHU）
    • Am
    • $m_2^6G$

  • 游离核苷酸及衍生物

    • NMP
    • NDP
    • NTP

第二信使cAMP/cGMP 环化核苷酸


  • 核苷酸生物学功能
    • 核酸单体
    • 携能物质（ATP/GTP/CTP/TTP）
    • 辅助因子之成分（NAD）
    • 细胞通讯媒介（cAMP/cGMP）

DNA结构·

核苷酸间 通过 3’-5’磷酸二酯键 连接。
DNA的分子走向是 5’-3’

  • 一级结构 连接的键 及 排列顺序 是 DNA的一级结构

    • 表示方式
      1. 结构式直接写结构
      2. 线条式用线条表示
      3. 字母式 5’ pApCpTpG 3’
        5’ ACTG 3’
        5’ pA-C-T-G 3’

    碱基组成规律：

    • A = T
    • G = C
    • A + G = T + C
    • A + C = T + G

  • 二级结构 双螺旋
    • 特点
      • 两条 反向平行 的 多聚核苷酸 沿一个 假想中心轴 右旋盘绕
      • 磷酸 和 核糖 单位为骨架 碱基内侧 互补配对
    • 属性
      • 螺旋 $ \phi $ 2nm
      • 上下碱基平面 d 0.34nm
      • 10个 bp 重复一次 3.4nm （一个旋）
    • 维稳
      • 碱基间 氢键
      • 碱基间 堆积力
      • 磷酸基上 O-被胞内 组蛋白/正离子 中和
      • 碱基处于疏水环境
    • 构象
      • A-DNA
      • B-DNA
      • C-DNA
      • D-DNA
      • Z-DNA
      • 三螺旋等
    • 意义
      • 是其复制/转录/逆转录的分子基础
      • 是遗传信息传递的分子载体
      • 奠定了分子生物学的基石

  • 三级结构 双螺旋分子通过 扭曲/折叠 形成不同结构
    • 超螺旋DNA

      L = T + W
      L：连环数，一条链绕另一条链缠绕的次数
      T：实际缠绕数，DNA分子的螺旋数
      W：超螺旋数
      超螺旋度： $ \lambda $ = ( L - L0 ) / L0 ，L0 为 松弛态DNA环数
      L不同，其他相同的DNA互为异构DNA
      拓扑异构酶I 通过使DNA的 一条链断开-再连接 使 超螺旋DNA 松弛。一次反应，L减少1，无需能量
      拓扑异构酶II 断开两条链 引入 负超螺旋。一次反应，L减少2，需能

      • 意义
        1. 增加压缩比
        2. 推动DNA结构变化 以完成特定功能

  • 核蛋白
    • 核小体组蛋白（H1，H3，H4，H2A，H2B）与DNA的结合单位

      长110 $ \text{\AA} $ ，高55 $ \text{\AA} $ ，DNA缠绕1.8圈，链长11nm，200bp

    • 纤丝

      30nm， 每圈6个核小体

    • 突环

      150nm， 约75000bp

    • 玫瑰花结

      300nm， 6个突环

    • 螺旋圈

      700nm， 每圈30个玫瑰花结

    • 染色体

      1400nm


RNA结构·

  • 一级结构 和DNA差不多，其中tRNA含有稀有碱基

  • tRNA二级结构 四环四臂，单链
    • I环：DHU环
    • II环：反密码子环
    • III环：可变环
    • IV环：TΨC环
    • 氨基酸臂：3’端

  • 三级结构 弯曲折叠
    • rRNA与蛋白质组成核糖体
    • mRNA
      • 原核：5’–先导区–|–顺反子–|–插入序列–|–顺反子–|–插入序列–|–顺反子–|–末端序列–3’
        先导区 + 多顺反子（翻译区） + 末端序列
      • 真核：5’–帽子–|–顺反子–|–polyA–3’
        m7G-5’ppp5’-N-3’p + 单顺反子 + AAAAAAA-OH

核酸的理化性质·

水解·

  • 酸水解 对酸敏感性：
    糖苷键 > 磷酸酯键
    嘌呤糖苷键 > 嘧啶糖苷键
    • 去嘌呤

      pH 1.6 37℃ / pH 2.8 100℃ | 1h

    • 去嘧啶

      98-100% HCOOH 175℃ 2h / CF3COOH 155℃ 1hDNA 80minRNA

  • 碱水解
    • RNA

      0.3-1mol/L KOH 室温 24h | 2’/3’-核苷酸 混合物

    • DNA

      水解不动
      意义：

      1. DNA要 传递遗传物质
      2. RNA完成任务 就要降解

  • 酶水解
    • 非特异性磷酸二酯酶
      • 蛇毒磷酸二酯酶

        产物：5’-磷酸核苷酸

      • 牛脾磷酸二酯酶

        产物：3’-磷酸核苷酸

    • 核酸酶底物专一性
      断裂方式：1. 5’-（寡）核苷酸/3’-（寡）核苷酸
      作用方式：
      1. 核酸外/内切酶
      2. 单/双/杂链核酸酶
      • RNase
        1. RNase H

          作用于 RNA-DNA中的 RNA链

        2. RNase I 牛胰核糖核苷酸酶

          3’-嘧啶核苷酸 / 以之结尾的寡核苷酸

        3. RNase T1

          3’-鸟苷酸 / 以之结尾的寡核苷酸

        4. RNase T2

          以 3’-AMP 结尾的寡核苷酸

      • DNase
        1. DNase I

          5’-磷酸为末端的寡核苷酸

        2. 核酸S1

          作用于 单链DNA

        3. DNA限制性内切酶

          严格的碱基专一性，如：EcoRI

        4. N-糖苷酶

酸碱性·

  • 碱基的解离
    • 胞嘧啶
      1. 3位 上的H     $ pK_1^1 $ = 4.6
      2. 2位 上的O变O-   $ pK_2^1 $ = 12.5
    • 尿/胸腺嘧啶
      1. 3位 上的H   U： $ pK_1^1 $ = 9.5 / T： $ pK_1^1 $ = 9.9
    • 腺嘌呤
      1. 1位N 上的H   $ pK_1^1 $ = 4.15
      2. 9位N      $ pK_2^1 $ = 9.8
    • 鸟嘌呤
      1. 7位N 上的H   $ pK_1^1 $ = 3.2
      2. 1位N 上的H   $ pK_2^1 $ = 9.6
      3. 9位N 上的H   $ pK_3^1 $ = 12.4
  • 核苷的解离
    • 戊糖可增加 酸碱解离
    • 核糖羟基也可以解离（ $ pK_1^1 $ > 12 ）

紫外吸收·

  • 吸收性质峰值波长：260nm
    天然DNA吸收最弱
    变性DNA吸收还行
    OD260 = 1 == 50 $ \mu g/ml $ 双链DNA
    OD260 = 1 == 40 $ \mu g/ml $ 单链DNA/RNA
    OD260 = 1 == 20 $ \mu g/ml $ 寡核苷酸
    DNA纯品 OD260 / OD280 = 1.8
    RNA纯品 OD260 / OD280 = 2.0

  • 经验公式 $ \varepsilon§ = \frac{ 30.98A }{ WL } $
    A：吸收值
    W：磷质量（g/L）
    L：比色杯内径
    $ \varepsilon $：mol吸光系数
    一般天然DNA $ \varepsilon $ = 6600
    一般天然RNA $ \varepsilon $ = 7800

复变性/杂交·

  • 变性 bp氢键断裂（跃变）

    • 变化

      $ A260_{ 增色效应 } \uparrow $   粘度 $ \downarrow $   F浮 / $ \rho \uparrow $   失去功能

    • 方法

      加热 Tm值：A260/2时，T值

    $ T_m \varpropto ( G + C ) $
    $T_{ m poly d(G-C) } > T_{ m DNA } > T_{ m poly d(A-T) } $
    $ G-C(%) = ( T_m - 69.3 ) \times 2.44 $


  • 复性 缓慢冷却，碱基重新配对

印迹法


核酸的研究方法·

提取分离与定量测定·

制备原则：防变性，防降解

  • DNA提取
    • 浓盐法
      1. SDS-浓盐（1mol/L NaCl） buffer 破碎细胞
      2. 离心提取清夜
      3. 加入 0.14mol/L NaCl 沉淀 DNA
      4. 酚/氯仿 纯化DNA

  • RNA提取 注意事项：

    1. 所用器皿须 高位培烤/高压灭菌/0.1%DEPC处理 后 煮沸处理
    2. 破碎细胞时加入强变性剂（胍盐）
    3. 在RNA反应体系中加入RNase抑制剂

    操作：

    • 分离 总RNA 用 异硫氰酸胍/苯酚/氯仿
    • 分离 poly(A)mRNA 用 寡聚TMP亲和层析法

  • 浓度测定
    • 定磷法（紫外分光法）
      • 加入浓硫酸/过氯酸，水解有机磷。
      • $ \ce{ H_3PO_4 + H_2MoO_4 ->[ 酸性条件 ] 24MoO_3\cdot P_2O_5\cdot 3H_2O( H_3PO_4\cdot 12MoO_3 ) } $
      • 用还原剂 还原之为 钼蓝（660nm）。测P含量计算。
    • 定糖法

      RNA 与 HCl共热，核糖 变为 糠醛。在 FeCl3催化下 其与 甲基苯二酚 反应呈 鲜绿（670nm）
      DNA 在酸性条件下 与 二苯胺共热后呈 蓝色（595nm）


  • 超速离心 CsCl密度梯度沉降
    • 测定 核酸密度
    • 测定 DNA中G-C
    • 测定 核酸构象
    • 制备 核酸

测序·

  • 酶法测序
  • 凝胶电泳
    • 琼脂糖
    • 聚丙烯酰胺
  • 化学测序 sanger测序：加减终止法

    将样本分为四份，每份分别加入 小比例的ddATP/ddGTP/ddCTP/ddTTP，其后，往四份样本中正常加入dNMP。于是，在DNA的合成中，ddNTP可能会取代dNMP的位置，一经取代，合成停止。电泳，我们就知道了样本1中dAMP的位置/样本2中dGMP的位置/样本3中dCMP的位置/样本4中dTMP的位置。


PCR·

DNA聚合酶链反应 *10^6 1985 Kary Mullis

  • 原料

    1. DNA模板
    2. 引物
    3. dNTP
    4. 缓冲液，Mg2+

  • 步骤

    1. 变性

      94℃ 30s 解离DNA

    2. 退火

      退到Tm引物-（3~5℃）℃ 30s

    3. 延伸

      70-72℃ DNA聚合酶催化反应

    以上循环25-30次


其他研究·

  • DNA的化学合成固相亚磷酸三酯
  • DNA微阵列
    • 测定基因型/突变
    • DNA测序
    • 测DNA表达谱

考点总结及名词解释·

有待补充