重组DNA技术简介
重组 DNA 技术简介·
由OPUS-4.8生成
概述·
- 基因重组的三个水平
整体水平（有性杂交）、细胞水平（细胞融合）、分子水平（一个生物的基因插入另一生物的 DNA 中，即狭义基因重组）。1972年 Berg 首次构建含 SV40 与 λ噬菌体 DNA 的 重组体（recombinant）。
- 重组 DNA 技术（20世纪70年代诞生）
将目的基因在体外与载体 DNA 连成重组体 → 转化宿主细胞 → 筛选能表达的活性宿主 → 繁殖扩增 → 表达目的基因产物。因过程类似连续复杂的工程，又称 遗传（基因）工程、基因克隆、分子克隆。
- 克隆（clone）：无性繁殖系。基因工程中指含单一 DNA 重组体的无性系或建立该无性系的过程。
- 两大重要步骤：① 构建 DNA 重组体；② 重组体的扩增和表达。
基因工程的相关技术·
DNA 的变性与复性·
- 变性（denaturation / melting）
破坏双链氢键和疏水作用的因素（加热>70℃、极端 pH、有机溶剂等）使碱基间氢键断裂，双螺旋 完全分开成单链。
- 复性（renaturation）：变性 DNA 在适当条件（如降温）下两条链重新缔合成双螺旋。
- 杂交（hybridization）
不同来源的互补核酸序列通过退火缔合成 杂交分子（hybrid），可为 DNA/DNA、RNA/RNA 或 DNA/RNA。
分子探针寻找特定基因·
探针（probe）：带标记的 单链 DNA 或 RNA 片段，用于检测互补序列。
- 要求：纯一、不含其他核酸、必须为单链（双链 DNA 探针须先变性；寡核苷酸和 RNA 探针无需变性）。
- 原理：探针与样本单链 DNA 中的互补序列碱基配对形成双链，识别后即可分离目的基因。
几种印迹与杂交技术·
- Southern 印迹：检测特定 DNA 序列，分析基因结构。
- Northern 印迹：分析 RNA（mRNA），确定哪类基因活跃表达，提供选择性表达、表达量及 mRNA 大小信息。
- 原位杂交（in situ hybridization）：检测完整细胞中的核酸序列，确定特定 mRNA 在单个细胞中的表达。
- FISH（荧光原位杂交）：荧光标记探针与变性染色体杂交，确定基因在染色体上的位置，在基因定位与作图中有特殊价值。
聚合酶链反应（PCR）·
在 体外 快速扩增特定基因/DNA 序列的技术，数小时可将极微量目的基因扩增数十万至数亿倍。
- 原理：双链模板高温变性成单链；Taq DNA 聚合酶 以单链为模板、用4种 dNTP 合成互补链；需一小段双链 DNA 作 引物 启动。
- 三个基本反应（一个循环）
①高温变性：95℃约1min，双链→单链模板。
②低温退火（annealing）：约55℃约1min，引物结合靶区两端互补序列。
③适温延伸（extension）：72℃数分钟，dNTP 从引物3′端按 5′→3′ 延伸合成互补链。 - 扩增效果：反复循环，20~30个循环后，理论最高拷贝数为 $2^n$。
基因工程主要的工具酶·
限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）·
在特定 DNA 位点切断 DNA 的酶（限制酶），水解磷酸二酯键，如基因操作的"手术刀"。已发现200多种，分 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型，重组 DNA 最常用 Ⅱ型。
- Ⅱ型酶特点
有特异 识别序列（靶序列），酶切位点在识别序列内，最常见为 4或6个核苷酸对。
- 两种切割方式
黏性末端（sticky end）：两链断裂位置交错、围绕轴线对称，产生互补单链末端（如 PstI 产生3′突出黏性末端）。
平齐末端（blunt end）：同一位置切割，无单链突出（如 ScaI）。
DNA 连接酶·
催化相邻 3′-OH 与 5′-P 间形成磷酸二酯键、拼接两段 DNA。
- 切口 vs 缺口
能封闭 切口（nick）（3′-OH 与 5′-P 相邻、位于互补配对的两核苷酸末端）；不能封闭缺口（gap）（缺失一或几个核苷酸的单链断裂）。
- 体外连接 DNA 片段的3种方法
①DNA 连接酶连接 互补黏性末端；②T4 DNA 连接酶直接连 平齐末端（或先用末端转移酶加 poly(dA)-poly(dT) 尾）；③先加 衔接物/接头 形成黏性末端再连接。共同点是利用 DNA 连接酶连接封闭单链 DNA。
反转录酶（reverse transcriptase）·
从反转录病毒制备，以 DNA 或 RNA 为模板、以3′-OH 的 DNA/RNA 为引物，按 5′→3′ 合成 DNA 链；还有 RNase H 活性（水解杂交分子中的 RNA 链）。
- 主要用途：以 mRNA 反转录合成互补 DNA（cDNA），也可合成标记探针。
基因克隆的质粒载体·
- 载体（vector）
将外源 DNA 送入宿主细胞扩增或表达的运载工具（也是 DNA 分子）。克隆载体（扩增 DNA）与 表达载体（表达产生蛋白）。常用三类：质粒、噬菌体、病毒。
- 质粒（plasmid）
细菌染色体外、能 自主复制 的小型双链 环状 DNA（酵母杀伤质粒是 RNA）。
- 优良克隆载体质粒的特性
①有 复制起点（自主复制的基本条件，一般一个）；②携带易筛选的 选择标记（如抗生素抗性基因）；③有多种限制酶的 单一识别位点；④相对分子质量小、拷贝数高；⑤安全性（宿主范围有限、不重组转移、不产生有害性状、不自由扩散）。
- pBR322 实例
应用最广的大肠杆菌质粒载体。优点：4361bp 分子量小；一个复制起点（ori）;两种抗生素抗性基因作选择标记；拷贝数高（氯霉素扩增后每细胞 1000~3000 份）。此外还有 pUC 系列、λ噬菌体、M13 等。
重组 DNA 的基本步骤·
一、获得目的基因·
- 1. 限制酶酶切产生片段
完全酶切（6核苷酸识别序列，平均每 $4^6$≈4096 bp 一个切点，重复性好、图谱特征性）；部分酶切（得到随机切断的各种大小片段，提供尽可能多的完整基因，常用于构建文库）。
鸟枪法（shot-gun method）：基因组 DNA 酶切后不经电泳直接与载体连接的克隆方法。
基因文库（gene library）：代表整个基因组的 DNA 片段插入载体、转化大肠杆菌后收集保存的遗传物质库。 - 2. 人工合成 DNA
DNA 合成仪可合成编码多肽的基因（15~30bp 效果最好，大基因用分段装配法）。先决条件：核苷酸序列已知。
- 3. 反转录酶酶促合成法
以目的多肽的 mRNA 为模板 → 反转录酶合成 cDNA → 以 cDNA 为模板合成编码 DNA。适用于断裂的真核基因，可构建 cDNA 文库。
- 4. PCR 扩增特定片段
用位于待扩增片段两端的两个寡核苷酸引物定向扩增，产物可克隆分析或作探针。
二、DNA 分子的体外重组·
将外源 DNA（目的基因）插入载体连接成 重组 DNA 分子（重组子）。
- 黏性末端连接法：用同一种（或2种）限制酶消化载体和外源 DNA 产生相同黏性末端，退火互补后 DNA 连接酶封口。
- 平齐末端连接法：可用 T4 DNA 连接酶（但底物浓度高、效率低），通常先 加接头或加尾改造成黏性末端 再连接。
三、引入宿主细胞与筛选鉴定·
- 宿主细胞：主要为 大肠杆菌（E. coli），还有枯草芽孢杆菌、酿酒酵母（生长快、易培养、遗传背景清楚）。
- 插入灭活法（insertion inactivation）筛选
pBR322 带 四环素抗性（Tetʳ） 和 氨苄青霉素抗性（Ampʳ） 两个标记。
外源 DNA 插入 Tetʳ 基因使其失活 → 重组质粒为 Ampʳ Tetˢ。转化后涂布 Amp 平板，再原位影印到 Tet 平板：在 Amp 平板能长、Tet 平板不能长的菌落即含重组体的阳性克隆。
基因工程的应用及其成果·
- 1. 新型疫苗、胰岛素、生长激素
乙肝疫苗：酵母生产 HBsAg，是 第一个真核细胞基因工程商业化产品。
胰岛素：1978年用人工合成基因 + pBR322 转染大肠杆菌成功生产人胰岛素，2000L 菌液≈1t 猪胰脏产量、便宜50%。
人生长激素：1979年基因工程生产，225kg 菌液≈6万人脑垂体产量。 - 2. 动物基因工程与品种改良
转基因生物（transgenic organism）：导入并整合外源基因（转基因 transgene）、能遗传给后代的生物。
朱作言（1985）用显微注射获转基因鱼（MT启动子 + hGH融合基因）；生物"反应器"如转基因绵羊乳腺分泌 α-1-抗胰蛋白酶 治肺气肿。 - 3. 转基因农作物：抗虫棉、抗玉米螟玉米、产β-胡萝卜素大米、抗除草剂玉米/大豆等。
- 4. 基因诊断与基因治疗
基因治疗（gene therapy）：引入正常功能基因纠正/补偿缺陷。1990年首例（ADA 缺乏致 SCID，导入 ada 基因）；我国1991年首例血友病B治疗。生殖系（种系）基因治疗 尚有争议（改变精卵基因、遗传给后代，涉伦理）。
基因诊断（gene diagnosis）：产前检查羊水/绒毛膜诊断遗传病，DNA 探针 发挥重要作用。
遗传工程的风险和伦理学问题·
转基因技术是 一把双刃剑。
- 安全措施：严格实验室操作规定；用于重组的微生物须 遗传缺陷型（不能在实验室外存活）；禁止明显危险的实验（如"驱寒"工程菌 Frostban 经安全测试后才允许流通）。
- 伦理与生态担忧
是否有权改变物种基因、向自然引入新物种；抗除草剂基因传给杂草产生 “超级杂草”；基因治疗的安全与伦理问题。
- 监管：转基因食物上市前须经环境、毒性、致敏性等长期监测和安全评估。
- 测序变革：推动第二代"超高通量测序"和第三代测序技术，使全基因组测序进入崭新时代。