重组 DNA 技术简介·

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概述·

• 基因重组的三个水平

  整体水平（有性杂交）、细胞水平（细胞融合）、分子水平（一个生物的基因插入另一生物的 DNA 中，即狭义基因重组）。1972年 Berg 首次构建含 SV40 与 λ噬菌体 DNA 的 重组体（recombinant）。

• 重组 DNA 技术（20世纪70年代诞生）

  将目的基因在体外与载体 DNA 连成重组体 → 转化宿主细胞 → 筛选能表达的活性宿主 → 繁殖扩增 → 表达目的基因产物。因过程类似连续复杂的工程，又称 遗传（基因）工程、基因克隆、分子克隆。

• 克隆（clone）：无性繁殖系。基因工程中指含单一 DNA 重组体的无性系或建立该无性系的过程。
• 两大重要步骤：① 构建 DNA 重组体；② 重组体的扩增和表达。

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基因工程的相关技术·

DNA 的变性与复性·

• 变性（denaturation / melting）

  破坏双链氢键和疏水作用的因素（加热>70℃、极端 pH、有机溶剂等）使碱基间氢键断裂，双螺旋 完全分开成单链。

• 复性（renaturation）：变性 DNA 在适当条件（如降温）下两条链重新缔合成双螺旋。
• 杂交（hybridization）

  不同来源的互补核酸序列通过退火缔合成 杂交分子（hybrid），可为 DNA/DNA、RNA/RNA 或 DNA/RNA。

分子探针寻找特定基因·

探针（probe）：带标记的 单链 DNA 或 RNA 片段，用于检测互补序列。

• 要求：纯一、不含其他核酸、必须为单链（双链 DNA 探针须先变性；寡核苷酸和 RNA 探针无需变性）。
• 原理：探针与样本单链 DNA 中的互补序列碱基配对形成双链，识别后即可分离目的基因。

几种印迹与杂交技术·

• Southern 印迹：检测特定 DNA 序列，分析基因结构。
• Northern 印迹：分析 RNA（mRNA），确定哪类基因活跃表达，提供选择性表达、表达量及 mRNA 大小信息。
• 原位杂交（in situ hybridization）：检测完整细胞中的核酸序列，确定特定 mRNA 在单个细胞中的表达。
• FISH（荧光原位杂交）：荧光标记探针与变性染色体杂交，确定基因在染色体上的位置，在基因定位与作图中有特殊价值。

聚合酶链反应（PCR）·

在 体外 快速扩增特定基因/DNA 序列的技术，数小时可将极微量目的基因扩增数十万至数亿倍。

• 原理：双链模板高温变性成单链；Taq DNA 聚合酶 以单链为模板、用4种 dNTP 合成互补链；需一小段双链 DNA 作 引物 启动。
• 三个基本反应（一个循环）

  ①高温变性：95℃约1min，双链→单链模板。
  ②低温退火（annealing）：约55℃约1min，引物结合靶区两端互补序列。
  ③适温延伸（extension）：72℃数分钟，dNTP 从引物3′端按 5′→3′ 延伸合成互补链。

• 扩增效果：反复循环，20~30个循环后，理论最高拷贝数为 $2^n$。

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基因工程主要的工具酶·

限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）·

在特定 DNA 位点切断 DNA 的酶（限制酶），水解磷酸二酯键，如基因操作的"手术刀"。已发现200多种，分 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 型，重组 DNA 最常用 Ⅱ型。

• Ⅱ型酶特点

  有特异 识别序列（靶序列），酶切位点在识别序列内，最常见为 4或6个核苷酸对。

• 两种切割方式

  黏性末端（sticky end）：两链断裂位置交错、围绕轴线对称，产生互补单链末端（如 PstI 产生3′突出黏性末端）。
  平齐末端（blunt end）：同一位置切割，无单链突出（如 ScaI）。

DNA 连接酶·

催化相邻 3′-OH 与 5′-P 间形成磷酸二酯键、拼接两段 DNA。

• 切口 vs 缺口

  能封闭 切口（nick）（3′-OH 与 5′-P 相邻、位于互补配对的两核苷酸末端）；不能封闭缺口（gap）（缺失一或几个核苷酸的单链断裂）。

• 体外连接 DNA 片段的3种方法

  ①DNA 连接酶连接 互补黏性末端；②T4 DNA 连接酶直接连 平齐末端（或先用末端转移酶加 poly(dA)-poly(dT) 尾）；③先加 衔接物/接头 形成黏性末端再连接。共同点是利用 DNA 连接酶连接封闭单链 DNA。

反转录酶（reverse transcriptase）·

从反转录病毒制备，以 DNA 或 RNA 为模板、以3′-OH 的 DNA/RNA 为引物，按 5′→3′ 合成 DNA 链；还有 RNase H 活性（水解杂交分子中的 RNA 链）。

• 主要用途：以 mRNA 反转录合成互补 DNA（cDNA），也可合成标记探针。

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基因克隆的质粒载体·

• 载体（vector）

  将外源 DNA 送入宿主细胞扩增或表达的运载工具（也是 DNA 分子）。克隆载体（扩增 DNA）与 表达载体（表达产生蛋白）。常用三类：质粒、噬菌体、病毒。

• 质粒（plasmid）

  细菌染色体外、能 自主复制 的小型双链 环状 DNA（酵母杀伤质粒是 RNA）。

• 优良克隆载体质粒的特性

  ①有 复制起点（自主复制的基本条件，一般一个）；②携带易筛选的 选择标记（如抗生素抗性基因）；③有多种限制酶的 单一识别位点；④相对分子质量小、拷贝数高；⑤安全性（宿主范围有限、不重组转移、不产生有害性状、不自由扩散）。

• pBR322 实例

  应用最广的大肠杆菌质粒载体。优点：4361bp 分子量小；一个复制起点（ori）;两种抗生素抗性基因作选择标记；拷贝数高（氯霉素扩增后每细胞 1000~3000 份）。此外还有 pUC 系列、λ噬菌体、M13 等。

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重组 DNA 的基本步骤·

一、获得目的基因·

• 1. 限制酶酶切产生片段

  完全酶切（6核苷酸识别序列，平均每 $4^6$≈4096 bp 一个切点，重复性好、图谱特征性）；部分酶切（得到随机切断的各种大小片段，提供尽可能多的完整基因，常用于构建文库）。
  鸟枪法（shot-gun method）：基因组 DNA 酶切后不经电泳直接与载体连接的克隆方法。
  基因文库（gene library）：代表整个基因组的 DNA 片段插入载体、转化大肠杆菌后收集保存的遗传物质库。

• 2. 人工合成 DNA

  DNA 合成仪可合成编码多肽的基因（15~30bp 效果最好，大基因用分段装配法）。先决条件：核苷酸序列已知。

• 3. 反转录酶酶促合成法

  以目的多肽的 mRNA 为模板 → 反转录酶合成 cDNA → 以 cDNA 为模板合成编码 DNA。适用于断裂的真核基因，可构建 cDNA 文库。

• 4. PCR 扩增特定片段

  用位于待扩增片段两端的两个寡核苷酸引物定向扩增，产物可克隆分析或作探针。

二、DNA 分子的体外重组·

将外源 DNA（目的基因）插入载体连接成 重组 DNA 分子（重组子）。

• 黏性末端连接法：用同一种（或2种）限制酶消化载体和外源 DNA 产生相同黏性末端，退火互补后 DNA 连接酶封口。
• 平齐末端连接法：可用 T4 DNA 连接酶（但底物浓度高、效率低），通常先 加接头或加尾改造成黏性末端 再连接。

三、引入宿主细胞与筛选鉴定·

• 宿主细胞：主要为 大肠杆菌（E. coli），还有枯草芽孢杆菌、酿酒酵母（生长快、易培养、遗传背景清楚）。
• 插入灭活法（insertion inactivation）筛选

  pBR322 带 四环素抗性（Tetʳ） 和 氨苄青霉素抗性（Ampʳ） 两个标记。
  外源 DNA 插入 Tetʳ 基因使其失活 → 重组质粒为 Ampʳ Tetˢ。转化后涂布 Amp 平板，再原位影印到 Tet 平板：在 Amp 平板能长、Tet 平板不能长的菌落即含重组体的阳性克隆。

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基因工程的应用及其成果·

• 1. 新型疫苗、胰岛素、生长激素

  乙肝疫苗：酵母生产 HBsAg，是 第一个真核细胞基因工程商业化产品。
  胰岛素：1978年用人工合成基因 + pBR322 转染大肠杆菌成功生产人胰岛素，2000L 菌液≈1t 猪胰脏产量、便宜50%。
  人生长激素：1979年基因工程生产，225kg 菌液≈6万人脑垂体产量。

• 2. 动物基因工程与品种改良

  转基因生物（transgenic organism）：导入并整合外源基因（转基因 transgene）、能遗传给后代的生物。
  朱作言（1985）用显微注射获转基因鱼（MT启动子 + hGH融合基因）；生物"反应器"如转基因绵羊乳腺分泌 α-1-抗胰蛋白酶 治肺气肿。

• 3. 转基因农作物：抗虫棉、抗玉米螟玉米、产β-胡萝卜素大米、抗除草剂玉米/大豆等。
• 4. 基因诊断与基因治疗

  基因治疗（gene therapy）：引入正常功能基因纠正/补偿缺陷。1990年首例（ADA 缺乏致 SCID，导入 ada 基因）；我国1991年首例血友病B治疗。生殖系（种系）基因治疗 尚有争议（改变精卵基因、遗传给后代，涉伦理）。
  基因诊断（gene diagnosis）：产前检查羊水/绒毛膜诊断遗传病，DNA 探针 发挥重要作用。

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遗传工程的风险和伦理学问题·

转基因技术是 一把双刃剑。

• 安全措施：严格实验室操作规定；用于重组的微生物须 遗传缺陷型（不能在实验室外存活）；禁止明显危险的实验（如"驱寒"工程菌 Frostban 经安全测试后才允许流通）。
• 伦理与生态担忧

  是否有权改变物种基因、向自然引入新物种；抗除草剂基因传给杂草产生 “超级杂草”；基因治疗的安全与伦理问题。

• 监管：转基因食物上市前须经环境、毒性、致敏性等长期监测和安全评估。
• 测序变革：推动第二代"超高通量测序"和第三代测序技术，使全基因组测序进入崭新时代。

本章名词·

反转录病毒｜retrovirus　⭐真题

反转录病毒是一类含有反转录酶的RNA病毒。其基因组为RNA，在宿主细胞内可经反转录酶催化，以RNA为模板合成双链DNA，并能整合到宿主基因组中。某些反转录病毒携带病毒癌基因（如src），具有致癌作用，可在感染宿主后诱发肿瘤。

干扰素｜interferon　⭐真题

干扰素是受病毒感染的细胞所产生的一组具有抵抗病毒感染作用的蛋白质。它属于先天免疫的重要组成部分，能够通过多种机制干扰病毒复制。目前可利用基因重组技术将干扰素基因导入酵母等宿主细胞中，实现大量生产。

生长激素｜growth hormone，GH

生长激素（growth hormone，GH）是由腺垂体分泌的一种蛋白质类激素，主要生理功能是促进蛋白质的合成，从而促进机体的生长。在儿童时期，若生长激素缺乏将导致侏儒症，分泌过多则引起巨人症；成人生长激素异常增多可导致肢端肥大症。

DNA连接酶｜DNA ligase

DNA连接酶是一种核酸酶，催化DNA中相邻的3′-羟基和5′-磷酸基末端之间形成磷酸二酯键，从而将两段DNA拼接起来。它只能封闭双螺旋骨架上的切口（nick），即当缺口处核苷酸完整且末端彼此相邻时才能连接，无法填补缺失一个或多个核苷酸的缺口（gap）。在基因工程中，DNA连接酶常用于体外重组，例如连接黏性末端或平末端，以构建重组DNA分子。

变性｜denaturation

DNA变性是指由于加热、极端pH或有机溶剂等因素破坏DNA双链的氢键和疏水作用，导致碱基对间氢键断裂，双螺旋完全分开成两条单链的过程，也称熔解。变性是可逆的，在适当条件下（如降低温度），分开的单链可重新缔合恢复双螺旋结构，即复性。

反转录酶｜Reverse transcriptase

反转录酶(reverse transcriptase)是从反转录病毒中制备得到的一种酶，能以DNA或RNA为模板，以带有3’-OH的DNA或RNA为引物，从5’→3’方向聚合生成DNA链。该酶还具有核酸酶H活性，可专一地以外切方式水解DNA/RNA杂交分子中的RNA链。其主要用途是从mRNA反转录合成互补DNA(cDNA)，也可用于合成标记核酸探针。

核酶｜Ribozyme

核酶是一类具有催化活性的RNA分子，能够催化分子内或分子间的化学反应。某些核酶催化分子内反应时，自身既作为底物又作为催化剂，通过特定的折叠形式实现催化功能；另一些核酶催化分子间反应，自身在反应前后不发生变化。核酶参与了细胞内多种重要过程，如RNA加工和线粒体DNA复制，其发现打破了所有酶都是蛋白质的传统观念，并对研究生命起源中RNA与蛋白质的出现顺序提供了线索。

基因｜gene

基因是遗传的基本功能单位，化学本质为DNA（或RNA）上特定的碱基排列序列，可通过编码蛋白质或功能RNA来控制生物体的表型性状。基因位于染色体上，具有多效性，即单个基因可影响多种表型。许多性状由多对微效基因共同决定，基因间可通过重组率进行染色体定位。

抗生素｜antibiotic

抗生素是一类由微生物产生或人工合成的、能抑制或杀灭其他微生物的化学物质。它们常用于治疗细菌感染，例如通过消灭牛胃中的微生物影响消化功能。但某些抗生素（如链霉素、卡那霉素）长期使用可能损害内耳毛细胞，导致感音性聋。

疫苗｜vaccine

疫苗是由灭活或减毒的病原微生物、其成分或产物制成的生物制品，用于预防传染病。它通过注射或口服进入体内，诱发机体产生特异性免疫应答，从而获得对该病原体的免疫力。传统疫苗包括灭活疫苗、减毒疫苗和成分疫苗等类型；现代基因工程技术还可生产如酵母表达的乙肝疫苗等新型疫苗。

质粒｜plasmid

质粒是细菌细胞内独立于染色体之外的小型双链环状DNA分子（酵母杀伤质粒为RNA），能自主复制，通常含有复制起点、选择标记（如抗生素抗性基因）和多种限制酶单一切点，作为基因克隆载体，可将外源DNA导入宿主细胞进行扩增或表达。

PCR｜Polymerase chain reaction

聚合酶链反应(PCR)是一种在体外模拟DNA复制过程、快速扩增特定基因或DNA序列的技术。其原理是：双链DNA模板经高温变性解链为单链，降温退火使引物与模板互补结合，再在适温下由Taq DNA聚合酶以dNTPs为原料催化新链延伸合成。通过多次循环这三个步骤，可在数小时内将微量目的DNA扩增数十万乃至数亿倍。

重组｜recombination

重组是指不同DNA分子或基因发生重新组合的过程，包括细胞内的自然重组和基因工程中的体外重组。自然重组主要发生在减数分裂前期，同源染色体非姐妹染色单体间发生交换，导致连锁基因重新组合，增加子代遗传变异，是进化的重要驱动力。体外重组则是将外源DNA片段插入载体DNA，常用限制酶切产生黏性末端或平末端，再通过DNA连接酶连接，形成重组DNA分子，用于基因克隆和表达。

反转录｜reverse transcription

反转录是指在反转录酶催化下，以RNA为模板合成互补DNA（cDNA）的过程，是中心法则中遗传信息从RNA流向DNA的关键环节。反转录酶具有依赖RNA的DNA聚合酶活性，能以RNA为模板，在引物存在下沿5’→3’方向合成DNA链，同时其RNase H活性可水解RNA-DNA杂交链中的RNA。该过程主要见于反转录病毒，并在基因工程中广泛用于从mRNA获得cDNA。

复性｜renaturation

复性是指变性DNA在适当条件下（如降低温度），两条彼此分开的互补单链通过碱基配对重新缔合形成双螺旋结构的过程。该过程依赖于氢键和疏水作用的恢复，使单链DNA重新形成稳定的双链。复性是核酸分子杂交技术的基础，在分子生物学中具有重要应用。

基因文库｜gene library

基因文库是指用限制性内切酶切割生物体的基因组DNA，将所得的DNA片段与载体连接并导入宿主细胞，所构建的包含该生物全部基因的克隆集合。常通过鸟枪法获得，即酶切后不经凝胶电泳分离直接与载体连接，从而得到大量包含不同DNA片段的克隆。基因文库为基因工程中筛选和获取目的基因提供了重要来源。

基因诊断｜gene diagnosis

基因诊断是通过检测基因结构、序列或表达水平的异常来诊断遗传性疾病或其他相关疾病的方法。它通常基于DNA重组技术、分子杂交或PCR等分子生物学手段，直接分析致病基因的突变或表达状态，为疾病确诊、风险预测和治疗方案选择提供依据。

基因治疗｜gene therapy

基因治疗是指向受体细胞中引入具有正常功能的基因，用以纠正或补偿基因的缺陷，或是利用引入基因以杀死体内的病原体或恶性细胞。它分为体细胞基因治疗和生殖系基因治疗，前者将基因导入体细胞，后者改变性细胞并可遗传后代，但后者存在伦理争议。例如，首例临床基因治疗通过导入腺苷脱氨酶基因至淋巴细胞，治疗了腺苷脱氨酶缺乏引起的严重联合性免疫缺陷症。

聚合酶链反应｜polymerase chain reaction

聚合酶链反应(PCR)是一种在体外模拟细胞内DNA复制过程，快速扩增特定基因或DNA序列的技术。其基本原理包括高温变性使双链DNA解开为单链、低温退火使引物与模板结合、适温延伸由Taq DNA聚合酶催化合成新链三个步骤的循环。该技术能在数小时内将微量目的DNA扩增数百万倍，需依赖DNA聚合酶、引物和四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)。

抗性基因｜resistance gene

抗性基因是指赋予生物体对特定不良环境因素（如杀虫剂、病原物或昆虫）抵抗能力的基因。例如，家蝇中的DDT抗性基因通过突变产生，使个体对杀虫剂具有抗性，但可能伴随生长速度降低的适合度代价。在转基因农作物中，导入抗虫或抗除草剂的抗性基因可增强植物的防御能力。这类基因在自然选择下，其频率会随环境压力变化而改变。

黏性末端｜sticky end

黏性末端是指DNA经限制性内切核酸酶切割后，两条链的断裂位置交错且围绕对称轴排列，产生的两个互补的单链末端。这些单链末端能通过碱基互补配对退火形成双链结构，因此可促进不同DNA分子间的特异性连接。在体外重组中，选择相同限制酶处理载体和外源DNA，可产生相同的黏性末端，退火后由DNA连接酶封口，形成重组DNA分子。黏性末端连接法效率较高，是基因工程常用的连接方法之一。

生长因子｜growth factor

生长因子是由某些体细胞分泌的一类蛋白质，能够作为外部信号促进其他细胞的分裂。它们通过与靶细胞表面的特异性受体（如酪氨酸激酶受体）结合，激活信号转导途径，从而推动细胞周期进程。不同生长因子对特定细胞类型具有专一性，在动物体内参与伤口愈合等过程。

探针｜probe

探针是一种带有标记的单链DNA或RNA片段，用于通过分子杂交检测具有互补序列的核酸。探针可以是克隆或PCR扩增的DNA、人工合成的寡聚核苷酸或体外转录的RNA，必须纯一且呈单链状态，双链DNA探针使用前需变性解链。探针借助碱基互补配对与靶序列结合，从而识别和定位特定基因或核酸序列，常用于基因分离与鉴定。

限制性内切核酸酶｜restriction endonuclease

限制性内切核酸酶是一类在特定DNA位点切断DNA的酶，能水解磷酸二酯键，将完整DNA分子切割成若干片段，被称为基因操作的“手术刀”。其中Ⅱ型限制酶最常用，具有特异性识别序列，酶切位点位于识别序列内，识别序列通常由4或6个核苷酸对组成。其切割方式之一是产生交错断裂，形成互补的黏性末端。

无毒性基因｜avirulence gene

无毒性基因是病原物中编码能被宿主抗性基因特异性识别的效应蛋白的基因，其存在使病原物在携带相应抗性基因的宿主上表现为无毒力。

胸腺嘧啶｜thymine

胸腺嘧啶（thymine）是脱氧核糖核酸（DNA）特有的含氮碱基，属于嘧啶类。在DNA双螺旋中，胸腺嘧啶与腺嘌呤通过两个氢键互补配对，参与维持双链结构。其核苷酸形式为脱氧胸苷酸，是DNA的组成单位之一。

荧光原位杂交｜fluorescence in situ hybridization

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）是一种以荧光标记的核酸探针与完整细胞内的靶核酸序列杂交，通过检测荧光信号来定位和鉴定特定核酸序列的技术。它基于原位杂交原理，可确定组织中特定mRNA在单个细胞中的表达情况。该技术还可用于检测和证实未培养微生物（如古生古菌门）的存在。

遗传工程｜genetic engineering

遗传工程是指通过DNA重组等技术直接操纵生物体的遗传物质，从而改变其遗传性状的方法。它允许人为制造新的微生物、植物或动物，具有巨大的潜在利益，但也存在制造危险病原体等潜在威胁，被视为双刃剑，并引发伦理学问题。

载体｜carrier

载体（carrier）通常指生物膜上的一类转运蛋白（载体蛋白），它能特异性地与被转运的离子或分子结合，通过自身构象变化将其从膜的一侧运至另一侧，实现顺浓度梯度的被动转运（易化扩散），如葡萄糖载体蛋白。

原位杂交｜in situ hybridization

原位杂交(in situ hybridization)是一种在完整细胞或组织切片中直接检测特定核酸序列位置的技术。它利用标记的单链核酸探针，与细胞内靶mRNA或DNA进行碱基配对杂交。通过杂交信号定位，可显示不同细胞类型中特定基因在单个细胞水平的表达情况。

杂交分子｜hybrid molecule

杂交分子是由不同来源的互补核酸单链通过退火相互缔合形成的双链分子。它基于碱基配对原则，可在DNA与DNA、RNA与RNA或DNA与RNA之间形成。杂交分子的形成是核酸杂交技术的核心，常用于检测序列同源性或特定核酸序列的定位与分析。

转座子｜transposon

转座子（transposon）是基因组中可移动的DNA序列，能通过转座酶介导的“剪切-粘贴”或“复制-粘贴”机制改变其在基因组中的位置，常伴有末端反向重复序列。转座子可引起基因突变、重组和基因组重排，是基因组进化的关键因素。

Ti质粒｜Ti plasmid

Ti质粒是存在于根癌农杆菌中的一种质粒，其T-DNA片段含有编码细胞分裂素和生长素合成的关键基因，可在感染植物后整合到宿主基因组中，导致植物激素过量合成，从而引起细胞快速分裂和冠瘿瘤的形成。